Способ получения а-интерферона человека

изобретение относится к биотехнологии, генной инженерии н касается способа получения ,ыннтерферона.Целью зобретения является повышение вык да конечного продукта за 1 счет присоединения структурного гена зрелого о/-интерферона через новое рибосомное связывание через линкерную последовательность с вектором рВВЗ 22. .Функцноналиэаци полимерного мате-20 динг риала-носителя осуществляют по изве-Ц стным способам, при этом в качестве материала-носителя служит НРЬС-силикагель (шаспегеу 5 Па 3 е 1, размер зерен 20 мм, размер пор 200 А). Его дериватнэнруют известны методом за исключением того, что стадию сУкцинилировання осуществляют с помощью аигидрида янтарной кислоты в безводномПНРНДННЕ. Защищенные. НУКЛЕОЗЦЦЫ СЕНТ ЗЫВЮТ КОБЗЛЕНТНО С. СИЛИКЕГВЛЕМ СОответственно следующей формуле ц . венгр-О Одельная нагрузка составляет 68 .104 моль нуклеозида на 1 г матернапа-носителя.отсасывают в вакууме, затем добавляют по 0,5 мл толуола и ТГФ н снова выпаривают, остается бесцветное вспененное твердое вещество. Этот продукт не анализируют на его чистоту,а растворяют в 10,0 дмл абсолютного пиридина. Раствор хранят под аргоном при -20 С вплоть до дальнейшего применения (в течение одной недели). Аналогично получают раствор нукле ноандфосфорохлоридита в 10,0 мл пири дина-из 640,0 мг (10 ммоль) 5-диметокситритил-Ыивобутнлудезоксиаунозина.Аналогично получают раствор нуклеоаидфосфорохлорндита в 10,0 мл пиридина ие 683,7 мг (1 О ммоль) 5-днметокситритилП 4-бензоил-девоксицити 5-Днметокситритил-Птбензонл-1-дезоксиаденозин-З-хлорметоксифос фат. Аналогично получают раствор это го нуклеозидфосфороклоридита в50 мг (5 мкмоль) содержащего ДТгАъ 7 полимерного носителя (пример 1) вносят в стеклянную-фритту. Затем добавляют различные растворители и растворы реактивов, носитель в ней кратковременно встряхивают,раствор после требуемого взаимодействняснова удаляют, с помощью тока аргона его вытесняют вверх через фритту. 05-днетокситритил-тимидина (вмтгат) растворяют в 1,0 мл абсолютного ТГФ и этот раствор при -78 Слв течение 15 мин в атмосфере аргона прикапъшают к перемешиваемому раствору0,9 моль метил-дихлорфосфита в 0,5 мл абсолютного пиридиа и . 2,0 мл абсолютного ТГФ. После 10 мин реакционный раствор нагревают до комнатной температуры и центриугнруют. Надосадочную жидкость переносят с помощью лиетки в сухую заполненную аргоном колбу со шлифом (25 мл). При комнатной температуре растворительв) 4 проывки по 4 мл абсолютным пиридином .-гд наконденсацня блиайшей нуклеотидной единицыдля чего 1 мл пиридннового раствора 5-диметокситритил-дезокситиидин-З-хлорметоксифосфита (примерно 100 рмоль) под аргоном добавляют в фритту к полимерному носителю н встряхивают его в растворе,(время реакции 10 ми.) .е) окисление сложньм триэфиром фосфористой кислоты с помощью 100 мг йода, растворенного в 3 мл смеси из ТГФ, лутндина и воды (221) (время реакции ми)и) 4 проывки по 3 мл нитромета нон. Цикл от стадии а до стадии и повторяют четырежды с Использованием 151 1 можно рассчитать загрузку материала 20НОСИТПН ДИМЭТОКСИТРНТИПЬНЫМИ ЗЗЩИТ ными группами. Получают 434 моль/г,что соответствует среднему выходу 85 на стадию конденсации. Отщепленне метильнх остатков от триэфирных групп фосфорной кислоты осуществляют следующим образом. Мат териал носителя в течение 45 мин встряхивают в 4 мл раствора тиофенала, триэтиламина и диоксана (112),затем промывают метанолом, после этого эфиром. Отщепление защитных для основанийГРУПП И ОДНОНРЭМЕННО ОТЩЕПЛЕНИЕ ГЭК .саннуклеотидной цепи от полимерного носителя проводят следующим образом. Материал носителя в течение 14 ч нагревают с 10 мл концентрированного аммиака при 50 С водны раствор за тем отсасывают и фильтрат концентрируют в вакууме примерно до 2 мл.Таким образом,-полученный сырой продукт, которьй на 5 конце содержит еще диетокснтритильную защитную группу, подвергают воздействию обратимой фазы НРЬС. Колонна Вопаараъ С фирмы Шавегв. Элент 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер рН 7 с 252 ацетонитрила, истечение 2 мл/мин,время удерживания 14 мин. 0 бъединен 50 ные (собранные) фракции после злюиф рования концентрируют приерно до объема 1 мл, смешивают с 10 мл 80 ной уксусной кислоты и оставляют на 30 мин при комнатной температуре. За 55 тем концентрируют в вакууме при 50 С досуха, остаток растворяют в 25 мл воды и отщепленный днметокси тританол экстрагируют 3 раза поной последовательности нуклеотидного структурногоэлемента.После наконденсацни последнего НУКд 90 ТНдН 0 ГО структурного элемента МЭТЕРНЗЛ НОСИТЕЛЯ ВЫСУШИВЗЮТ В вакууме масляного насоса, пробу взвеши вают с точностью до 1 мг и смешивают С 10,0 мл 0,1 М раствора толуолсульч фокислоты в ацетонитриле. Путем происходящего при этом отщепления диме токситритил-катиона получают оранжевоткрасный раствор, абсорбция которого измеряется при Ц 98 нм, по формуле1 1 . 15 мл эфиром. Водную.фазу снова кон 1 центрируют досуха, остаток растворя ЮТ Е 2,5 МЛ ВОДЫ, обессоливают наВ качестве контроля чистоты служит аналитическая НРЪСдиаграмма(колонна 300 х 3,8 мм дьвопарап С фирмыьшавегз, элюенты 0,1 М триэтил аммонийацетатный буфер рН 7 с 12 ацетонитрила, истечение 1,5 мл/мин время удерживания 3,7 мин).Получают аналогично примеру 2,ЬНРЬСдиаграма продукта колонна 300 х 3,9 м, р Вопаарай Ст фирмы Иайегв элюент 0,1 М триэтиламмонийацетатный буфер рН 7 с 12 ацетонит рила истечение 1,5 мл/мин время Удерживания 4,4 мин.Получают аналогично примеру 2,исходя из 200 мг (16 д 4 мопь) дмтгасьг Р.НРЬС-диаграмма продукта колонна 300 х 3,9 мм, р.ВопаараЬ Си фирмы Иавегв элюент 0,1 М триэтиламоний ацетатный буфер рН 7 с 122 зцетонитрипа, истечение 1,5 мл/мин, время удерживания 3,4 мин. ОПолучают аналогично примеру 2,исходя из 150 мг 1,32 дьмоль)НРЬСдиаграмма продукта колонна 300 х 7,8 м, д Вопдараь С, фирмы Пасете элюант 0,1 М триэтипамонийч ацетатный буфер рН 7 с 202 ацетонитПолучают аналогично примеру 2,исходя из 200 мг (1 б,2 рхмоль) ДМТг 3 ЪгР.НРЬС 5 диаграмма продукта колонна 300 х 7,8 мм, н Вопоарап 018, фирмыПолучают аналогично примеру 2,исходя из 250 мг (22 дммоль) длтгаАг.НРЬСдиаграмма продукта колонна 300 х.7,8 мл, Н Вопбарап С , фирмы Иатегед элюент 0,1 М трнэтнламмони ацетатн буфер рН 7 с 25 ацетоннтрила, истечение ,5 мл/мин, время удерживания - 6,1 мин.Получают аналогично примеру 6, исацетатный буфер рн 7 с 20 ацетонитрила истечение 0,2 мл/мин, время удерживания - 5,2 мин. дП р и м е р 9. Анализ последовательностей синтетически полученных олигодеоксинуклеотидов осуществляют после того как-они встроены винтерС ПОМОЩЬЮ ЭООГО анализа ОДНОВРЕМЕННОЭЛЮНРУЮТ ИЗ геля. ЭТОТ ФРЭГМЕНТ затем переваривают с помощью Нае 111, оба продукта переваривания разделяют на 6-ном полиакриламидном геле, и фрагмент длиной 90 Ьр (промотор/оператор снова выделяют из геля.ЕВБ составлена из трех синтетических олнгонуклеотидов 6-мера12-мера 5-тААссАсстттд. 500 р-моль-6-мера фосфолируют с помощью фермен та ПОЛННУКПЭОТНДКИНЗЗЫ И ПРИ ЭТОМрадиоактивно маркируют. Реакционную смесь в течение 10 мин нагревают при 70 С чтобы инактивировать кина 3 у после чего добавляютгэквиолярные количества (не фосфорнлированных)10 мера И 12-мера, смесь олнгонуклеоти20 дов нагревают до 90 С и затем медлен но (примерно через 3 ч) охлаждают до 30-35 С, причем олигонуклеотиды гибридиэуются друг с другом31 АШТТСТАЦАВАБТАЧАС Оп шпат Вппг ьцьцБлагодаря добавке.0,25 ммоль АТР и 5 ммольДтТ 6-мер и 10-мер с помощью фермента ДНК-лигаэы ковалентно связывают друг с другом. Отсутствие фосфатных остатков на 5-концах 12 мера н 10-мера предотвращает возникновение многомерных продуктов лигатуры. После реакции нагревают в течение 10 мин при 70 С, чтобы инактинроватьП р и м е р 10. Плазмид рВВ 101,который содержитприерно 1000 Ьр триптофан-оперона 5 еггаЬ 1 а шагсеесене, представляет собой исходнй материал для выделения промотор/оператор-области-(региона). Этот регуляторный регион (область) находитсяной 90 Ьр в котором промотор ориентирован в направлении Есо Н 1 д Нее 111.Примерно 25 длг плазмида рВВ 101 переваривают рестрикционной системой ЕсоВ 1 два образующися фрагмента отделяются друг от друга путем гельвлектрофореза (14 агароцы) н фрагмент длиой 200 Ър электрофоретнчески0,5 ммоль АТР н 5 моль ДТТ в даль нейшую реанцю киназы. Затем киазичг руют 5-концы 12-мера и 10-мера, благодаря чему получается ЕВ 5.12 р-моль Есо Е 1 Нае 111 промотор/ операторчфрагмента длиной 90 Ър лигнруют в стандартных условиях с помощью 60 рмоль ВВБ. Кап только полученный благодаря Нае 111 разрезу тупой конец 90 Ърфрагментаможет лигироваться с тупым концом ВВ 8, образуются молекуы, которые содержат ВВБ в направлении ориентации вниз от промотора, После реакции лигазу О ниактивируют в течение 10 мин при 7 ОС устанавливают концентрацию ТА буфера и дополнительно переваривают с помощью 200 единиц Н 1 п 111 и 10 единиц Есо Е 1. Это предпочтительно для того, 7чтобы в образующихся в реакции МУЛЬ тимерак пгазы(так как наряду с желательной реакцией могут лигироваться друг с другом как Есо Е 1-концы,так И Н 1 пб.111 концы) снова превращать в мономеры. Затем пробу разделяют на 6-ном полиакриламидном геле и вырезают длиной примерно 100 Ър промотор/операторВВБфрагмент (который имеет Есо В 1-концы н Н 1 па 111 концы) из геля и электрофоретнчески-элюируют, чтобы отделить от избыткаП р нлм е Рч 11. 2 дг плазмцда рВР 322 с помощьюрестринционных ферментов Есо В 1 и наша 111 разрезают, причем образуются два фрагмента большой с 4332 Ър и малый с 29 Ър Большой фрагмент путем электрофореза на 0,8-ном геле агарозы отделяют от маленького, вырезают из геля И элюируют. Примерно 0,4 р-моль этого фрагмента затем лигируют приерно 10 р-моль промотор/оператор-ВВБ-фраг-25 мента. Д -.рВВ 322-фрагмент из-за своих двух,не пододящмх друг к ДРУГУ, выступающих концов не может легироваться сам с собой, поэтому промотор/оператор-ВВБтфрагмент может лнгироваться только в одной ориентации в плазмаде, происходит промотирование в направлении Н 1 п 111 место среза до тетрациклинрезнстентного гена РВВ 322.ЕзсЬег 1 сЬ 1 а со 11 НВ 101 с помощью. реакционной смеси последнего лигирования трансформируют известным способом, и трансфрманты селектируют на содержащих амицилли агаровыхклеткн выращивают до ПЛОТНОСТИ ПРИ мерно 2 х 10 клеток/мл. Клетки пеллетируют н суспендируют в 100 мысль раствора СаС 1 д (20 мин при ОС). После этого клеткиннкубируют с реанционной смесью реакции лигазы в течение 5 мин при О-4 С И В течение5 мин при З 7 С. После добавки 0,5 1 мл 1-бульона ннкубируют далее в течение 15-30 мин при 37 С. 19 трансформантов выбирают н с помощью Нае 111-рестрнкцнонных перевариванн исптывают на и возможное содержание промотор/оператор-ВВЗфрагментасреза в рВВ 322 влево от Есо В 1 месрта среза 103 Ьр промотор/операторВЕ 5 фрагмента 145 Ър Н 1 п 111 места среза вплоть до ближайшего Наео 111-места среза вправо от него,В РВВ 322). Из 19 отобранных трансформантов 18 обладают ожидаемым образцом переваривания. Для того, чтобы установить пра вильность сконструированного Экспрес сионного плазмида один из этих плазмидов (рЕВ 103) подвергается после-. дователъному анализу и его положение устанавливается в рВН 322. Последовательны анализ проводится по методу Махаш И Б 11 ЪегЪ И происходит от Есо Е 1 места среза в направлении Н 1 по 111-места среза (и сверх него), также от Н 1 п 111 места среза в направлении Есо В 1 мместа среза (и сверх него). 7 рЕВ 103 таким образом представляет собой экспрессионнй плазмнд ко-1 торый содержит промотор/операторную область триптофанового оперона Бег гар 1 а тагсеэсепв в комбинации с ситетнческой ЕББ. Этот новый экспрес снонный ппазмщдпромотирует транскрицю генов, которые встраиваютсяП р и ме р 12. Примерно 1 мкг Р 9 Ь 1 ВСТаБКИ 1 Е 7 переваривается с помощью-рестрикционной системы Зап ЗА. Из 62-ного полиакриламищного геля выделяют длиной 177 Ър фрагмент,который простирается от Зап ЗА-места среза после ПН 2 концевого цистеинкодона вплоть до блиайшего Баш ЗАместа среза и содержит АЧа 111 местосреза. Его обрабатывают одной едини цей щелочной фосфатаэы нпосле удаления фосфатазы благодаря экстракцииэтанола. Фрагмент затем гидролиэуют с АЧЪ 11, благодаря чему получается желательный фрагмент 34 Ьр Баи ЗА-А АУа 11 и 143 Ър-фрагмент. Параллельно этому из плазмида ЭР 7 выделяют интерферон - специфически бдб Ьр АЧа 11-фрагмент, которьй простирается от АЧа 11 - места среза внутри 177 Ьр Баи ЗА-фрагмента.вплоть за концевой кодон. Примерно 0,5 мкг этого 646 Ьр АЧа 11 фрагмента теперь вместе со смесью из 34 Ьр и 143 Ьр Зап ЗА-АЧа 11 фрагментов инкубнруют