Штамм бактерий Bacillus subtilis БИМ В-262, обладающий антагонистической активностью в отношении фитопатогенов плодовых или ягодных культур

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИЙБИМ В-262,ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ФИТОПАТОГЕНОВ ПЛОДОВЫХ ИЛИ ЯГОДНЫХ КУЛЬТУР(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Коломиец Эмилия Ивановна Романовская Татьяна Витальевна Молчан Ольга Владиславовна Здор Наталья Анатольевна Лобанок Анатолий Георгиевич Супранович Ромуальд Владимирович Плескацевич Ромуальда Иосифовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Штамм бактерийБИМ В-262, обладающий антагонистической активностью в отношении фитопатогенов плодовых или ягодных культур. Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, предназначено для защиты плодовых и ягодных культур от болезней и касается нового штамма - основы биопрепарата, который эффективен против фитопатогенных грибов и бактерий - возбудителей парши (.), бактериального рака яблони (. ), обыкновенного (европейского) рака яблони , а также серой гнили земляники ( ), распространенность и вредоносность которых в последние годы увеличилась как в крупных промышленных садах государственных хозяйств, так и на участках садоводов-любителей. Известны способы защиты плодово-ягодных культур от болезней с помощью химикатов (азофоса, препаратов групп бензимидазолов, фениламидов дикарбоксимидов, триазолов и др.). Однако применяемые химические пестициды со временем утрачивают свою эффективность из-за распространения устойчивых к ним рас фитопатогенов. Кроме того, в плодоводстве, как и в сельском хозяйстве в целом, использование химических препаратов приводит к негативным экологическим и санитарно-гигиеническим последствиям нарушениям структуры биоценозов, накоплению высокотоксичных органических соединений в почве и воде, ухудшению качества получаемой продукции. Загрязнения окружающей среды и продукции остатками стойких пестицидов, употребление фруктов и ягод,10904 1 2008.08.30 в основном, в свежем виде предопределяют необходимость использования экологически безопасных методов биологического контроля фитопатогенов, основанных на явлении антагонизма микроорганизмов. Несмотря на очевидную потребность в микробных средствах борьбы против парши и раковых болезней плодовых, универсальных штаммовантагонистов с широким спектром действия против возбудителей этих болезней не выявлено. В связи с этим поиск микроорганизмов-антагонистов, эффективных в отношении наиболее вредоносных болезней плодовых и ягодных культур, вызываемых как грибными,так и бактериальными фитопатогенами, и разработка новых средств защиты на их основе является актуальной задачей. Известен используемый против бактериального рака плодовых биопрепарат Пентафаг,действующим началом которого являются вирионы пяти штаммов бактериальных вирусов и биологически активные вещества, образующиеся в результате лизиса бактерийвозбудителей 1. Однако бактерио-фитопатогены, вызывающие европейский рак, паршу плодовых и серую гниль земляники. Известен штамм бактерий-330-, эффективный против бактериального рака винограда 2, однако отсутствуют сведения о его действии на развитие возбудителей парши и рака (европейского и бактериального) плодовых культур и серую гниль земляники. Известен штамм бактерийЦМПМ В-2895, предложенный для борьбы с возбудителем серой гнили земляники 3, однако спектр его антагонистического действия также не распространяется на возбудителей парши и раковых болезней плодовых культур. К недостаткам изобретения можно отнести выбор способа культивирования штамма (поверхностный), обусловливающий необходимость длительного его выращивания для накопления биомассы, применение дорогостоящих пищевых наполнителей и использование энергоемкого и длительного метода сушки. Вызывает сомнение также правильность выбора питательной среды для культивирования бактериального штамма(сусло-агар). Известен штамм бактерийВНИИСХМ 131, используемый для получения препарата против возбудителей гнилей яблок и винограда при хранении 4. Однако спектр действия данного штамма ограничен грибными фитопатогенами и не затрагивает возбудителей болезней бактериальной этиологии. Кроме того, приготовление препарата на его основе повторяет недостатки предыдущего аналога. Известны штаммы бактерий 40489,40490 и 40491 для предотвращения заболевания фруктов или овощей после сбора урожая 5. Однако данные штаммы также оказывают ограниченное действие, направленное на отдельных грибных возбудителей родови , вызывающих гнили сельскохозяйственной продукции при хранении. Известен штаммВ-6615 для получения препарата, используемого для стимуляции роста и защиты растений от грибных патогенов в процессе вегетации и при хранении урожая 6, однако он отличается от заявленного штамма по спектру антагонистической активности и номенклатуре сельскохозяйственных культур, на которых он применяется (зерновые, картофель). Известен штамм бактерийВНИИСХМ 128 - основа биопрепарата Фитоспорин, который характеризуется антагонистической активностью в отношении ряда фитопатогенных бактерий и грибов и предназначен для защиты различных видов сельскохозяйственных и декоративных растений, в том числе древесных 7. Обработка препаратом на основе этого штамма семян ели и сосны уменьшает поражение саженцев фузариозом. Однако штамм характеризуется низкой активностью в отношении фитопатогенных бактерий рода(зона подавления роста тест-культур 6-10 мм), его антагонистическое действие не распространяется на возбудителей болезней плодовых деревьев - паршу и рак, штамм не проявляет ростстимулирующих свойств. 2 10904 1 2008.08.30 Наиболее близким техническим решением (протопипом) является штамм бактерий 24 Д (ВНИИСХМ 129) - основа препарата Интеграл, характеризующийся как антифунгальными, так и антибактериальными свойствами, и предназначенный для предпосевной обработки семян и вегетирующих растений сельскохозяйственных культур,плодовых деревьев и ягодных кустарников 8. Однако он имеет ряд недостатков 1) отсутствуют сведения об антимикробной активности штамма в отношении возбудителей наиболее вредоносных болезней плодовых и ягодных культур (парши, рака, серой гнили) 2) пример применения штамма для защиты плодовых и ягодных культур от болезней не подтвержден экспериментальными данными эффективности его действия 3) не выявлена способность штамма стимулировать рост растений. Для улучшения развития растений авторы предлагают добавлять к культуральной жидкости (КЖ) бактерий гуматы и микроэлементы в количестве 25- 30 от итогового веса препарата, что, несомненно, увеличивает его стоимость и усложняет технологию получения 4) способность к образованию бактериями спор приводится как основа повышения сохранности препарата, однако в характеристике препарата не указывается значение титра спор, а представлен лишь титр клеток (5-109 кл/мл) КЖ бактерий. Задачей изобретения является получение нового непатогенного штамма-антагониста с более широким спектром антимикробного действия по сравнению с известными аналогами, эффективного против возбудителей наиболее вредоносных болезней плодово-ягодных культур грибной и бактериальной этиологии, который также характеризуется ростстимулирующими свойствами. Предлагаемый штамм выделен из ризосферной почвы с использованием мембранной камеры, образованной двумя дисками мембранных фильтров Синпор-2. В качестве тестобъекта использовали фитопатогенный гриб. Отмытый мицелий гриба помещали в камеру, которую устанавливали в сосуд объемом 500 мл с почвой и выдерживали 4 сут. при температуре 24 С. По истечении этого срока камеру извлекали из почвы, помещали в колбу со стерильной водой и встряхивали на качалке 30 мин. Из суспензии делали высевы на МПА с целью получения изолированных колоний бактерийантагонистов, которые оценивали в качестве агентов биоконтроля различных фитопатогенных микроорганизмов с помощью различных методов (точечного тестирования, реплик, лунок, кольца, отсроченного антагонизма). Отобранный наиболее активный бактериальный изолят с широким спектром антагонистического действия идентифицировали по определителю, . 4, .., /, 1989) каки депонировали в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под регистрационным номером БИМ В-262. Способы хранения штамма 1) в пробирках на скошенном мясо-пептонном агаре при 4 С, рН 6,8-7,2, перевивка 1 раз в 6 месяцев 2) в лиофилизированном состоянии в ампулах, частота перезакладки в ампулы 1 раз в 5 лет. Культурально-морфологические свойства. При поверхностном культивировании на мясо-пептонном агаре образует округлые колонии серо-белого цвета с зубчатым или чуть волнистым краем поверхность гладкая. Клетки подвижные, представляют собой палочки бациллярной формы размером 0,60,71,0-1,3 мкм с округлыми концами. Споры эллипсовидные, расположены центрально или терминально. Спорангиум не раздут. Клетки расположены одиночно, в парах или коротких цепочках. Окраска по Граму положительная. Физиолого-биохимические признаки. 3 10904 1 2008.08.30 Облигатный аэроб. Растет при температуре 15-50 С. Оптимум 30-35 С. Отношение к источникам углерода штамм утилизирует глюкозу, сахарозу, галактозу,арабинозу, ксилозу, рамнозу, фруктозу, мальтозу, целлобиозу, трегалозу, рафинозу, инозит, дульцит, сорбит, глицерин, цитрат разжижает желатину, гидролизует крахмал не утилизирует лактозу, маннозу, пропионат. Отношение к источникам азота штамм ассимилирует сульфат аммония, нитрат аммония, нитрат калия, мочевину, пептон, кукурузный и дрожжевой экстракт, восстанавливает нитраты до нитритов Другие особенности обладает каталазной активностью, образует ацетоин, разлагает тирозин, растет на средах Мейнелла, Чапека, в 5-10. Штамм не является патогенным и токсигенным. Токсикологические исследования штамма проводили на лабораторных животных - белых мышах, крысах, кроликах. Установлено, что штамм при внутрижелудочном и внутрибрюшинном введении его суспензии в дозе 3,5-4,01010 спор/животное, а также интраназально - в дозе 1010 спор/животное не вызывает у белых крыс клинических симптомов интоксикации и гибели. В.БИМ В-262 не обладает раздражающим действием на слизистые оболочки глаз кроликов. При введении фильтрата 4-суточной жидкой культуры В.БИМ В-262 подкожно в заднюю лапку мышей в количестве 0,5 мл гибели опытных животных и некроза тканей в месте инъекции не выявлено. При лизисе клеток В.БИМ В-262 эндотоксины в окружающую среду не выделяются, так, внутрибрюшинное введение убитой подогреванием культуры не вызывает у животных клинических симптомов интоксикации, гибели,внешнего изменения тканей в месте инъекции. Проведенные исследования позволили сделать заключение о возможности использования штамма в микробиологическом производстве. Штамм В.БИМ В-262 не фитотоксичен, о чем свидетельствует отсутствие некротических пятен, ожогов и других изменений на листьях редиса после обработки культуральной жидкостью бактерий кончиков корней проростков (точки роста и меристематической зоны) в течение 1 ч и последующем инкубировании растений при 2224 С. В качестве контроля использовали замоченные в воде и питательной среде растения. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1 Культивирование штамма В.БИМ В-262 и исследование его антагонистической активности. Штамм выращивали в условиях глубинной ферментации на среде Мейнелла (г/л К 2 НРО 43 Н 2 О-7,0 КН 2 РО 4-3,0 472-0,1 (4)24-1,5 -цитрат-0,5), с мелассой (30 г/л) в качестве источника углерода в течение 36-48 ч при 28-30 С. Антагонистическую активность полученной культуральной жидкости (КЖ) бактерий с титром 4-9109 спор/мл определяли методом лунок по диаметру зон задержки роста фитопатогенов. Согласно полученным данным (табл. 1) заявляемый штамм эффективно подавляет рост широкого спектра грибных и бактериальных тест-культур и отличается от аналогов высокой антагонистической активностью к возбудителям болезней плодовых и ягодных культур. 10904 1 2008.08.30 Таблица 1 Спектр антифунгального и антибактериального действия бактерий-антагонистов Диаметр зоны подавления роста тест-объектов, мм Тест-объект В.БИМ В-262 аналоги Грибы-фитопатогены. (европей 35 нет данных ский рак плодовых)(пар 39 нет данных ша яблони)3 (парша 36 нет данных яблони)(парша 27 нет данных яблони)2-2 26 нет данных(парша яблони)(серая гниль зем 30-35 40 219-21 3 3-13, 6 ляники) 18, 8-30, 30-34 5 3040 6 13-15 7(гниль плодов не опр. 12-16 3 18-21 4 при хранении). (гниль плодов при 25 14-17 3 15-20 4 6-11 хранении) 5. (гниль плодов при не опр. 13-15 317-21 4 хранении). (гниль плодов при 26 3-12, 5-17, 17 5 хранении)(черная пятни 33 20 2 стость овощных культур)(альтернариоз не опр. 20-30 6 овощных и зерновых культур)(альтернариоз) 30 19-22 7(фузариоз 33 40210-133 11-13, 9 овощных, зернобобовых культур) 14 7(фузариоз зерно 30 40 2 20-40 6 7-9, 11 вых культур) 13 7(ризоктониоз 32 40 2 12-14 7 овощных культур) Бактерии-фитопатогены(гнили овощ 25 6-12 2 18-23 7 ных культурбактерине опр. 10-40 2 альный рак винограда)3-3 (бакте 37 нет данных риальный рак плодовых)4-1 (бакте 35 нет данных риальный рак плодовых)2-9 (бакте 38 нет данных риальный рак плодовых)1-1- (бак 40 нет данных териальный рак плодовых) 5 8511 не опр.(сосуди 31 стый бактериоз овощных культур)(бактериоз 26 19-22 7 бобовых культур)в описании протопипа 8 спектр действия не приведен Пример 2 Динамика роста и спорообразования бактерий В.БИМ В-262 при выращивании на среде с мелассой. Бактерии В.БИМ В-262 выращивали в условиях глубинной ферментации на питательной среде, описанной в примере 1, и контролировали титр клеток и спор общепринятыми методами. В соответствии с результатами, представленными в табл. 2, к концу наблюдений процесс спорообразования прошел практически полностью и достиг 96 . Таким образом, в условиях глубинного культивирования штамм по активности спорообразования превосходит прототип, высокое содержание спор в КЖ обеспечивает сохранность культуры в течение длительного хранения. Таблица 2 Динамика роста и спорообразования бактерий В.БИМ В-262 при выращивании в колбах на качалке Длительность В.БИМ В-262 В.24 Д (ВНИИСХМ 129) культивироваТитр клеток, /мл Титр спор, /мл Титр клеток, /мл Титр спор, /мл ния, ч 0 не указан не указан 1,8107 4,0103 8 3 6 не указан не указан 1,510 4,010 8 4 12 не указан не указан 4,910 7,010 24 не указан не указан 6,3108 2,8108 8 8 36 не указан не указан 8,610 6,810 9 9 9 48 не указан 9,810 9,410 510 Пример 3 Исследование ростстимулирующего действия бактериальной суспензии штамма В.БИМ В-262 на всхожесть семян и развитие проростков растений в стерильных условиях (опыт в чашках Петри). Для оценки влияния В.БИМ В-262 на всхожесть, предварительно продезинфицированные семена огурца (сорт Полянский) путем последовательной обработки 1 раствором 4 (15 мин) и 10 раствором Н 2 О 2 (15 мин) с последующим промыванием в дистиллированной воде замачивали в 2 растворе культуральной жидкости антагониста,полученной в результате глубинного культивирования (см. пример 1). Обработанные семена помещали в чашки Петри на увлажненные стерильные фильтры по 100 штук. По результатам фитоэкспертизы установлено, что обработка бактериями В.БИМ В-262 активизирует процессы прорастания семян, повышая всхожесть (на 17 ) и энергию прорастания семян (на 22,5 ) по сравнению с контролем, а также оказывает ростстимулирующее действие на развитие проростков, что проявляется увеличении массы корней и стеблей на 35 и 10 соответственно (табл. 3). Полученные данные показывают, что заявленный штамм способен к прямой стимуляции роста растений в стерильных условиях. 10904 1 2008.08.30 Таблица 3 Влияние В.БИМ В-262 на посевные качества семян и развитие проростков огурца Энергия Лаборатор- Масса корМасса стебля,Вариант опыта прорастаная всхо- ня,к конк контролю нияжесть,тролю В.БИМ В-262 98 95,0 135,3 110,0 Контроль (вода) 80 81,0 100,0 100,0 Пример 4 Ростстимулирующее и фитозащитное действие штамма В.БИМ В-262 в опытах на растениях огурца в почвенном агаре (ПА). Выращивание культуры проводили, как описано в примере 1. Продезинфицированные(пример 2) семена растений огурца замачивали в разбавленной в 50 раз КЖ бактерий. Затем семена промывали стерильной дистиллированной водой и проращивали в течение 2-3-х суток в термостате (при 24-25 С). Для исследования фитозащитного действия штаммаантагониста на инфицированном фоне проростки дополнительно погружали в суспензию фитопатогенов .181 (титр клеток 7-108) и .-55043 (титр КОЕ 8-107) и вносили в пробирки с почвенным агаром. В контрольных вариантах для замачивания семян использовали воду, разбавленную в 50 раз питательную среду Мейнелла, а также суспензии клеток фитопатогенов (без предварительной обработки антагонистом). Результаты развития проростков оценивали на 30 сутки инкубирования по весу корневой и стеблевой части контрольных и опытных растений (табл. 4-6). Таблица 4 Оценка ростстимулирующего действия В.БИМ 262 на растениях огурца в стерильном почвенном агаре Средняя масса проростка в пересчете на 1 растение, мг Вариант эксперимента стебель корень 1 (вода) 12,20,5 3,00,1 2 (среда Мейнелла) 10,60,4 3,90,2.БИМ 262 13,80,6 5,60,2 Таблица 5 Оценка фитозащитного действия В.БИМ 262 на растениях огурца на инфекционном фонев почвенном агаре Средняя масса проростка в Вариант эксперимента пересчете на 1 растение, мг стебель корень 1, (вода) 12,20,5 3,00,1 2 (.-55043, без обработки антагонистом) 6,30,3 2,60,1 В.БИМ 262.-55043 13,30,6 3,90,2 Таблица 6 Оценка фитозащитного действия В.БИМ 262 на растениях огурца на инфекционном фонев почвенном агаре Средняя масса проростка в пересчете Вариант эксперимента на 1 растение, мг стебель корень К 1 (вода) 12,20,5 3,00,1 К 2 (Р.181, без обработки антагонистом) 11,60,5 2,60,1 В.БИМ 262.181 13,90,6 5,00,2 7 10904 1 2008.08.30 Данные табл. 4 свидетельствуют о ростстимулирующем действии штамма, при обработке семян КЖ В.БИМ В-262 увеличение массы корневой системы составило 86 к контролю 1 (вода) и 44- к контролю К 2 (среда Мейнелла). Масса стеблевой части проростков при этом увеличилась на 13 и 30 соответственно. Благодаря обработке семян антагонистом фитозащитное действие В.БИМ В-262 В наиболее выражено на инфицированном фоне (табл. 5, 6). Пример 5 Биологическая эффективность КЖ бактерий В.БИМ В-262 против парши яблони. Испытания проводили в молодом плодоносящем яблоневом саду колхоза Узденский Минской области. В соответствии со складывающейся фитосанитарной ситуацией плодовые деревья опрыскивали пятикратно, КЖ бактерий В.БИМ 262 разбавляли водой в 20 раз (5 концентрация). Контролями служили варианты без обработки и с применением эталона (химического фунгицида азофос, 75 паста, РБ). Эффективность фитозащитного действия препарата оценивали по степени распространения и развития конидиальной стадии возбудителя парши яблони в течение вегетационного периода. В конце сезона контролировали общий урожай с дерева и выход первосортной продукции. К концу вегетационного сезона развитие парши на листьях достигает умеренного уровня и составляет 15,9 на листьях и 1,7 на плодах, что превышает эффективность применения эталона (26,5 на листьях и 3,0 плодах) (табл. 7). Таблица 7 Оценка биологической эффективности КЖ бактерий В.БИМ В-262 против парши яблониучет, июньучет, июльучет, август Вариант листья листья плоды листья плоды Р КЖ В.2,0 0,4 10,8 2,5 3,3 0,7 53,7 15,9 7,5 1,7 БИМ В-262 Эталон (азо 7,0 1,8 16,5 5,0 5,0 1,9 70,7 26,5 9,5 3,0 фос) К (без обра 21,0 6,9 44,0 14,7 9,3 2,7 95,0 44,5 53,5 27,3 ботки) Примечание Р - распространенность парши,- развитие болезни, . Учет общего урожая на модельных деревьях, а также проведенный расчет выхода первосортной продукции показали (табл. 8), что применение КЖ бактерий В.БИМ В-262 способствует повышению урожайности молодых плодоносящих деревьев яблони и получению высокого выхода первосортной продукции и по эффективности превосходит используемый эталон азофос (урожайность - на 20,8 ц/га, а выход первосортной продукции - на 12,8 ). Таблица 8 Эффективность использования КЖ бактерий В.БИМ В-262 против парши яблони Общий урожай Урожай в переВыход первосортВариант с 1 дерева, кг счете на 1 га, ц ной продукции,КЖ В.БИМ В-262 34,3 68,6 83,3 Азофос 23,9 47,8 70,5 Контроль 21,8 43,6 50,6 НСР 05 1,2 0,7 1,6 10904 1 2008.08.30 Пример 6 Биологическая эффективность КЖ бактерий В.БИМ 262 против раковых болезней яблони. Раковые раны плодовых культур зачищали до здоровой древесины, дезинфицировали 1 -ным азофосом (75 паста) и наносили лечебную замазку по следующей схеме 1. Эталон- лечебная замазка (глина и коровяк 11) - ЛЗ 2. Эталон- ЛЗ с добавлением биопрепарата пентафаг (20 мл на 1 кг замазки) 3. Нанесение на рану 10 КЖ В.БИМ В-262 с последующим замазыванием ЛЗ 4. Контроль - без лечения ран. Результаты испытаний представлены в табл. 9. Таблица 9 Антагонистическая активность штамма В.БИМ В-262 по отношению к возбудителям раковых болезней молодых насаждений яблони Размер ран Биологическая Площадь заВариант эффективпосле п/п живления до лечения ность,лечения 1 Эталон , ЛЗ 21,7 17,0 4,7 21,5 2 Эталон , ЛЗбиопрепарат 43,2 29,5 13,7 31,7 пентафаг 3 КЖ В.БИМ В 12,5 6,6 5,9 47,2 262 ЛЗ 4 Контроль 44,6 69,3-24,7 Примечание знак - означает увеличение площади ран. Полученные данные свидетельствуют о превосходстве использования В.БИМ В-262 для защиты яблони от раковых болезней, биологическая эффективность его составляет 47,2 , что на 15,5 выше, чем у аналога (Пентафага). Преимущество заявляемого штамма обусловлено более широким спектром действия и способностью его подавлять развитие двух возбудителей раковых ран, действующих в симбиозе - грибы .. и бактерии .. , в то время как Пентафаг характеризуется только антибактериальными свойствами и не эффективен против грибного фитопатогена. Таким образом, заявляемый штамм по важнейшим показателям - спектру антимикробного действия, ростстимулирующей активности, биологической эффективности превосходит известные аналоги и может использоваться для защиты плодовых и ягодных культур от болезней. Источники информации 1. Григорцевич Л.Н., Былинский А.Ф. Бактериофаг против возбудителя бактериоза плодовых // Актуальные проблемы биологической защиты растений Материалы науч.практ. конф., Прилуки, 15 апреля 1998 г. - Минск, 1998.- С. 46-47 (аналог). 2. Патент 1825446, МПК А 0163/00, С 121/20, 1990 (аналог). 3. А.с 1738200, МПК А 0163/00, С 121/20, 1989 (аналог). 4. А.с.1706504, МПК А 0163/00, С 121/20, 1990 (аналог). 5. Патент 2126210, МПК А 0163/00, А 0125/00, 1993 (аналог). 6. Патент 2121271, МПК А 0163/00), С 121/20, 1997 (аналог). 7. Патент 2099947, МПК А 0163/00, С 121/20, 1996 (аналог). 8. Патент 2216173, МПК А 0163/00, А 01 С 1/6, 2001 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 9