Способ ингибирования ретровирусной инфекции

61 38/55 ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РЕТРОВИРУСНОЙ ИНФЕКЦИИ(71) Заявитель АМГЕН БУЛДЕР Инк., СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ, МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ(73) Патентообладатель АМГЕН БУЛДЕР Инк.,СОЕДИНЕННЫЕ ШТАТЫ АМЕРИКИ,МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ(57) Способ ингибирования ретровирусной инфекции, вызванной вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ),включающий введение пациенту ингибитора сериновой протеазы лейкоцитов (СЛПИ) или его производного в количестве, достаточном для блокирования инфекции, отличающийся тем, что производное СЛПИ выбирают из группы, состоящей из СЛПИ 72 мутеина, СЛПИ 20 мутеина, СЛПИ 72 мутеина, СЛПИ 72 мутеина, СЛПИ 25 мутеина, СЛПИ 25 мутеина, СЛПИ 25 мутеина. Фиг. 1 Изобретение относится к области лечения ретровирусных инфекций, более конкретно, к лечению инфекции вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) и сопутствующего заболевания, включающего синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). 3137 1 Ретровирусные агенты причастны к ряду заболеваний, включая рак, аутоиммунное заболевание и СПИД. Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) вызывает хроническое прогрессирующее исчезновение СД 4 Т лимфоцитов (СД 4 клеток) и инфекцию макрофагов, приводя в результате к синдрому приобретенного иммунодефицита. Общераспространенный зидовудин (АЗТ), аналог тимидина является основным противовирусным лекарством, используемым при лечении инфекции ВИЧ, хотя используют также два других агента с подобным механизмом действиядидэзоксиинозин (ддИ) и дидэзоксицитозин (ддЦ).Т.Р. . .. . . (1990) 3221340-45 . .. . . (1987) 317185-91. Эти агенты являются эффективными при ингибировании вирусной репликации и могут стабилизировать уровни СД 4 клеток, но они не пригодны для уничтожения одного из основных вирусных образованиймакрофагов, инфицированных ВИЧ.. . .(1986) 233215-19. Высокую токсичность, особенно при ВИЧ костного мозга хозяина, связывают также с повышенными дозами АЗТ при лечении и уменьшением благотворного влияния лекарства после продолжительной терапии у пациентов, страдающих СПИД у пациентов,подвергнутых лечению, наблюдали также ВИЧ штаммы, резистентные к АЗТ. Эти находки побудили к поиску альтернативных лекарств для лечения инфекции ВИЧ, в частности агентов, отличающихся механизмом действия. Вирус иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1), ретровирус, является этиологичной причиной СПИД. Гликопротеиновая оболочка ВИЧ-1, 120, специфично связывается с СД 4 рецептором на Т лимфоцитах и на моноцитах и макрофагах. Хотя инфекция Т лимфоцитов требует клеточной пролифирации и синтеза ДНК,продуктивное заражение моноцитов может иметь место независимо от синтеза клеточной ДНК , . а 1. (1991) . . . 1741477-82. Если ВИЧ-1 заражает активированные СД 4 лимфоциты, это является летальным, но зараженные моноциты являются относительно резистентными к разрушению вирусом. Следовательно, эти клетки, однажды зараженные ВИЧ-1, служат в качестве долгоживущих резервуаров вируса. Но не только эти клетки являются источником репликации вируса, но их дисфункция, возникающая за счет вируса, может вносить вклад в повышенную восприимчивость к условно-патогенным инфекциям, которые являются признаком СПИД. Так как моноцит-макрофаги служат в качестве резервуаров для ВИЧ-1, введение селективной метки в эту популяцию, дополнительно к Т лимфоцитам, заслуживает дальнейшего рассмотрения , . а 1.2521703-05, 1991. Ранние сообщения группы 118709-711, 1989 указывают, что компонент слюны человека блокирует репликацию ВИЧ. Недавно. 24848-52, 1989 показал, что ингибитор триптазы (трипсин-подобного фермента) может ингибировать образование синцитий Т-клеток,индуцируемое ВИЧ. При исследовании различных потенциальных модуляторов инфекции ВИЧ-1 авторы идентифицировали эндогенный источник ингибирующей активности, который замедляет инфицирование и/или репликацию ВИЧ-1. Фактором, ответственным за противовирусную активность, является сериновый ингибитор протеазы лейкоцитов (СЛПИ). СЛПИ является сильнодействующим ингибитором эластазы лейкоцита человека и катепсинаи трипсина человека и был выделен из паротидных секреций , К. , (1986). . . . , 836692-96 ипатент 4760130. СЛПИ является теперь доступным за счет получения с помощью рекомбинантной ДНКпатентная заявка 07/712354, поданная 7 июня 1991 и заявка РСТ - публикация 86/03519, поданная 4 декабря 1985. Способность СЛПИ и/или его производных и аналогов блокировать инфицирование и/или репликацию ВИЧ-1 может обеспечить основание для терапевтического воздействия на инфекцию ВИЧ-1. Настоящее изобретение обеспечивает новый способ для профилактики или лечения ретровирусных инфекций клеток млекопитающих, в частности профилактику инфекции клеток человека, зараженного вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), и сопутствующих заболеваний, включая синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД). Изобретение обеспечивается фармацевтическими композициями для лечения ретровирусных инфекций, в частности инфекции ВИЧ у человека, которые включают сериновый ингибитор протеазы лейкоцитов(СЛПИ), или его аналог, или его производное и фармацевтически приемлемый носитель. Изобретение включает способ лечения инфекций ВИЧ в клетках человека, включающий введение ему эффективного количества СЛПИ или его аналога или его производного. На фиг.1. изображено, как СЛПИ блокирует репликацию ВИЧ в моноцитах в зависимости от дозы. Выделенные моноциты человека высевают на чашки и выдерживают с ВИЧ-СЛПИ в течение 1 часа при 37 С,промывают и инкубируют при 37 С, удаляя надосадочные жидкости и добавляя свежую среду каждые четыре дня. ЕС 50 для этих экспериментов была менее 0,1 мг/мл (8,5 наномоль) с полным ингибированием при 10 мг/мл (850 наномоль). Как показано на фиг 2, ингибирующий эффект СЛПИ является длительным. На 18 сутки ВИЧ еще ингибирован на 90 . 3137 1 Настоящее изобретение обеспечивает способы профилактики ретровирусов, в частности инфекции ВИЧ клеток млекопитающего, в частности клеток человека, и сопутствующих заболеваний, включая синдром приобретенного иммунодефицита человека (СПИД). Термин фармацевтически приемлемый носитель, как он использован здесь, обозначает нетоксичный,обычно инертный носитель для активного ингредиента, который не оказывает вредного влияния на ингредиент или на пациента, которому вводят композицию. Термин эффективное количество, как он использован здесь, обозначает предварительно определенное количество СЛПИ, или его аналога или его производного, достаточное для того, чтобы быть эффективным против ВИЧ. Согласно настоящему изобретению ретровирусные инфекции лечат введением противовирусных агентов в дозах, достаточных для снижения влияния таких инфекций. Ретровирусные инфекции причастны к ряду заболеваний, включая (но не ограничиваясь ими) рак, аутоиммунные заболевания и синдром иммуноприобретенного дефицита. Инфекция вируса иммунодефицита человека представляет особый интерес согласно настоящему изобретению. Различные противовирусные агенты известны в области, занимающейся этими проблемами. Большинство из них ингибирует активность ретровирусной ревертазы и включает зидовудин (АЗТ) аналог тимидина,дидэзоксиинозин (ддИ), и дидэзоксицитозин (ддЦ). Зидовудин является основным противовирусным лекарством, используемым при лечении инфекции ВИЧ. Противовирусные агенты являются обычно эффективными при дозах в области от около 50 мг/день до около 1000 мг/день, более предпочтительно, от около 100 мг/день до около 500 мг/день, и в случае зидовудина, соответственно от около 300 мг/день до 500 мг/день. Эти агенты обычно вводят в форме оральных композиций. Ингибиторы протеазы, использованные в этом изобретении, могут быть получены с помощью хорошо известных в этой области способов смотри патент США 4760130, Европейскую патентную заявку 85905 953.7, заявку РСТ 86/03519 и патентную заявку США 07/712,354. Настоящее изобретение относится к ингибиторам протеазы, которые выделены в чистой форме. Предпочтительно, сериновые ингибиторы протеазы по настоящему изобретению являются протеинами с однопептидной цепью, которые являются, по существу, гомологами, и более предпочтительно, биологически эквивалентными нативному сериновому ингибитору протеазы, выделенному из паротидных секреций человека. Нативный сериновый ингибитор относится также к нативному паротидному ингибитору. Термином биологически эквивалентный, как он использован повсюду в описании и в формуле изобретения, обозначают, что композиции способны ингибировать полученную из моноцита протеазу, которая ингибируется СЛПИ, но необязательно в той же самой степени. Термином производные, как используют повсюду в последующем описании и в формуле изобретения, обозначают степень гомологичности аминокислоты с нативным паротидным ингибитором, предпочтительно превышающую 40 , более предпочтительно 50 , с преимущественно предпочтительными группами протеинов, являющимися более чем на 60 гомологичными с нативным паротидным ингибитором. Процент гомологичности, как описано выше, расчитывают как процент компонентов, найденных в меньшей из двух последовательностей, которые могут быть найдены в большей из двух последовательностей, причем под компонентом понимают последовательность четырех соседних аминокислот. Одно из полезных СЛПИ производных представляет СЛПИ, усеченную молекулу СЛПИ, содержащую только последние 60 аминокислот нативного паротидного ингибитора. Этими 60 аминокислотами являются. Следующую нуклеотидную последовательность используют для кодирования приведенных выше молекул из 60 аминокислотССТАСС ССА АСА ССА АСАССТССАССТССТ. СЛПИ был построен за счет делегации из сигнальной последовательности СЛПИ гена и нуклеотидов, соответствующих первым 47 аминокислотам зрелого СЛПИ протеина, как описано в патентной заявке США 07/712354. СЛПИ может быть также получен по способу примера 8, описанному в заявке РСТ 86/03519 и Европейской патентной заявке 85 905 953.7. Хотя пример 8 в этих двух заявках раскрывает способы получения СЛПИ, этот способ может быть также использован для получения СЛПИ. СЛПИ может быть использован для выработки антител, пригодных для очистки СЛПИ. Антитела могут быть получены, например,3 3137 1 способами, описанными в ..,, .92-114, 1988. Термином аналоги, как он использован здесь, обозначают любое соединение, включающее, например,небольшие органические соединения, которые функционально биологически эквивалентны СЛПИ в ингибировании инфекции ВИЧ. Такие производные и аналоги могут быть выделены способами, хорошо известными специалистам в этой области, включающими использование клеток моноцитов для скринирования соединений, которые предотвращают связывание СЛПИ с ними. Аналоги могут также включать специфические СЛПИ мутеины, которые имеют по крайней мере эквивалентную, а в некоторых случаях более высокую активность, чем нативный протеин. Особенно полезные СЛПИ мутеины включают замещение следующих аминокислот в положениях остатка под номерами у 20,75,72,72. СЛПИ мутеины также обеспечивают осуществление изобретения. СЛПИ мутеины, которые соответствуют СЛПИ мутеинам Су 72,25 и 72 здесь называются как 25,25 и 25. Некоторые рассматриваемые СЛПИ мутеины имеют следующую аминокислотную последовательность 8, К 3,9,4567,где 7 представляет собой аланин и 3, 4, 5, 6, 8 и 9 являются одинаковыми или различными аминокислотами и один или более из 4, 3, 5, 6, 8 и 9 могут быть метионином, валином, аланином, фенилаланином, тирозином, триптофаном, лизином, глицином или аргинином. Аналоги также включают, например, -илированные формы СЛПИ или СЛПИ, который может иметь улучшенные терапевтические характеристики по сравнению с нативным протеином. Мутеины, которые могут быть пригодны для -илирования, включают мутеины, которые содержат цистеиновый остаток в положениях 13, 23, 52, 58, 68 и/или 75 СЛПИ и, при соответствующих сайтах 5, 11, 21 и 28 в СЛПИ. Получение цистеиновых мутеинов для -илирования раскрыто в заявке РСТ 92/16221, поданной 13 марта 1992 г., которая приводится здесь ссылкой. Полезная стадия при получении мутеина может включать стадию рефолдинга , в которой цистеин добавляют к раствору, содержащему протеин. Цистеин может добавляться в стадию разворачивания и может связываться с замещенным свободным цистеином в мутеине. Можно также выделить из моноцитов СЛПИ ингибируемый протеин (СИП) из моноцитных клеток человека,используя стандартные биохимические процедуры, хорошо известные специалистам в этой области, и выделять протеины с протеолитической активностью. После выделения протеина (и, при необходимости, его секвенирования, клонирования его гена и экспрессирования его в клетки хозяина, т.е. рекомбинантного получения СИП) можно скринировать его по способности ингибировать СИП с помощью приемов хорошо известных в этой области. Или же можно определять их структуру и конструировать из них ингибиторы также с помощью приемов хорошо известных специалистам в этой области. Если СЛПИ или его аналог, или производное используют для борьбы с инфекциями ВИЧ у человека, соединение может быть введено орально или парентерально, в носителе, включающем один или более фармацевтически приемлемых носителей, количество которого определяют растворимостью и химической природой соединения, выбранного пути введения и стандартной биологической практикой. Для орального введения СЛПИ или его аналога, или его производного, могут быть приготовлены стандартные дозированные формы капсулы или таблетки, каждая из которых содержит определенное количество активного ингредиента (от около 10 до 1000 мг, более предпочтительно для пациента -10-200 мг в день, а еще предпочтительнее для пациента - 20-200 мг в день) в фармацевтически приемлемом носителе. Для парентерального введения СЛПИ, его аналога или его производного, их вводят с помощью внутривенной или подкожной, или внутримышечной инъекции в композиции с фармацевтически приемлемыми связующими или носителями. Для введения путем инъекции главным образом используют соединение в растворе в стерильном водном носителе, которое может также содержать другие сорастворители буферы, консерванты, а также достаточные количества фармацевтически приемлемых солей или глюкозы для того, чтобы сделать раствор изотоническим. Подкожные инъекции являются предпочтительным путем введения. Дозы, в основном, являются такими же, как и те, которые определены выше для орального введения. Подходящие связующие или носители для отмеченных выше композиций могут быть найдены в стандартных фармацевтических руководствах, например, в, 16 .,, , , 1980. Дозы соединения будут меняться в зависимости от формы введения и свойств выбранного активного агента. Более того, они будут изменяться в зависимости от особенностей пациента или хозяина (людей, млекопитающих), которые подвергаются лечению. Обычно лечение начинают малыми дозами, существенно меньшими, чем оптимальная доза соединения. После этого увеличивают понемногу до оптимального эффек 4 3137 1 та, который достигают при данных обстоятельствах. Вообще наиболее желательно соединение вводить в концентрации, которая будет обычно приводить к эффективным противовирусным результатам без того,чтобы вызывать какие-либо нежелательные или разрушительные побочные эффекты. Желательно поддерживать уровень соединения в крови на уровне, достаточном для ингибирования ретровирусной инфекции клеток хозяина. Это может быть установлено опытным определением количества соединения, которое является эффективным для предотвращения ретровирусной инфекции клеток хозяина, например ВИЧ в моноцитах,, и затем, используя стандартную фармакокинетическую методику, определяют количество соединения,необходимое для сохранения уровня в плазме при одном и том же уровне ингибирования или вплоть до более чем в 10-100 раз. Хотя композиции, раскрытые здесь, являются эффективными и относительно безопасными для лечения инфекций ВИЧ, не исключена возможность сопутствующего введения этих композиций с другими противовирусными лекарствами или агентами для получения положительных результатов. Такие другие противовирусные лекарства или агенты включают растворимые СД 4, зидовудин, дидэзоксицитидин, фосфонформат рибаварин, противовирусные интерфероны (например, альфа-интерферон или интерлейкин-2) или аэрозоль пентамидина. Изобретение иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Моноциты периферической крови (МПК) выделяют от здорового донора, высевают на чашки с культурой и инкубируют в течение нескольких дней. СЛПИ смешивают с ВИЧ (Ва 1) и применяют к РВМ в течение 1 часа при 37 С. Клетки промывают и инкубируют в течение дополнительного времени с изменением среды и определением ревертазы в супернатантах каждые три дня. Считается, что СЛПИ эффективно блокирует репликацию ВИЧ при концентрации 1 мкг/мл (Фиг.1). При концентрациях менее или равных 20 мкг/мл ингибирование СЛПИ уменьшается. Эффект ингибирования является продолжительным, со значительным ингибированием, наблюдаемым на 18 день (Фиг.2). Пример 2. РВМ высевают на чашки и инкубируют, как в примере 1. СЛПИ выдерживают с клетками в течение около 1 часа, затем клетки промывают и обрабатывают ВИЧ. Меняют среду, и анализ проводят, как в примере 1. Считается, что СЛПИ более эффективен при блокировании ВИЧ, если клетки предварительно обрабатывают СЛПИ, чем если клетки обрабатывают смесью СЛПИ и ВИЧ. Пример 3. Демонстрируют в основном те же подходы, что и в примере 1, но заменяют Т-клетки на моноциты, так как СЛПИ является эффективным в ингибировании репликации ВИЧ в Т-клетках. Пример 4. Колонию клеток Т-лимфоцитов человека (Н-9) выдерживают в суспензии культуры 1640 с 10 фекальной телячьей сывороткой (ФТС) и 200 микрограммами на литр гентамицина. СЛПИ добавляют в среду культуры с конечной концентрацией 100 микрограмм на миллилитр. Спустя 24 часа клетки промывают, инокулируют в течение 4 часов ВИЧ штаммом 111 В, вновь промывают и ресуспендируют с плотностью 500000 клеток на миллилитр. Добавляют среду и выдерживают с СЛПИ с конечной концентрацией 100 микрограмм на миллилитр тотчас после ресуспендирования (Т 0) или два дня спустя после ресуспендирования (Т 2). Культуру супернатанта собирают и культуры подают каждые два дня. Супернатант собирают 8 дней спустя после инфицирования и анализируют на ривертазную активность измерением поглощения меченного тритием тимидина в поли (гА) -олигоматрицу. Как показано в табл. 1, в клетках, предварительно обработанных СЛПИ, ингибированная СЛПИ вирусная репликация составляет приблизительно 62 и 54 , при незамедлительном добавлении или спустя два дня после инфицирования, соответственно. Таблица 1 Клетки, предварительно обработанные СЛПИ Отрицательный контроль Активность Пример 5. Опыты проводят, как описано в примере 4, за исключением того, что 1000-кратно концентрированный штамм ВИЧ 111 В инкубируют 100 микрограммами СЛПИ в течение 6 часов на льду до инокуляции. Эту смесь ВИЧ/СЛПИ 1000-кратно разбавляют до инокуляции в течение 4 часов. 3137 1 Как показано в табл. 2, при использовании вируса и клеток, предварительно обработанных СЛПИ, СЛПИ ингибирует репликацию вируса приблизительно на 64 и 26 , при немедленном добавлении или спустя 2 дня после инфицирования, соответственно. Таблица 2 Вирус и клетки, предварительно обработанные СЛПИ Отрицательный контроль Активность Пример 6. Опыты проводят, как в примере 5, за исключением того, что используют чистые клетки, т.е. клетки, не культивированные СЛПИ до инокуляции. Использование чистых клеток и вируса, предварительно обработанного СЛПИ, дает ингибированную вирусную репликацию, приблизительно на 59 при немедленном добавлении и 32 спустя два дня после инифицирования соответственно (табл. 3). Таблица 3 Вирус, предварительно обработанный СЛПИ Отрицательный контроль Активность Пример 7 Опыты проводят как в примерах 4-6, за исключением того, что ни клетки, ни вирус не выдерживают с СЛПИ до инокуляции. Использование чистых клеток и чистого вируса дает ингибированную СЛПИ репликацию вируса приблизительно на 50 и 42 при немедленном и спустя два дня после инфицирования добавлении соответственно (табл. 4). В табл. 5 показана активность ревертазы, которая присутствует в культуре супернатанта, анализированной на 4, 6 и 8 сутки после инфицирования. Таблица 4 Чистые клетки и вирус Отрицательный контроль Активность Чистые клетки и вирус Отрицательный контроль 4 день (ср.ч. имп/мин) Стандартное отклонение 6 день (ср.ч. имп/мин) Стандартное отклонение 8 день (ср.ч. имп/мин) Стандартное отклонение 3137 1 Пример 8. Изучают также влияние различных СЛПИ мутеинов на вирусную репликацию. Чистые клетки Н-9 инкубируют чистым вирусом в течение 4 часов, как в примере 7. После промывания, клетки ресуспендируют с плотностью 500000 клеток на миллилитр в среде, содержащей 30 микрограмм на миллилитр СЛПИ или СЛПИ мутеинов, показанных в таблице 6. Культуру супернатанта анализируют на ревертазную активность спустя 8 дней (табл. 6). Таблица 6 Отриц. контр. Активность КТ Пример 9. Опыты проводят, как в примере 8, за исключением того, что после инокуляции клетки ресуспендируют в среду, содержащую 100 микрограмм на миллилитр СЛПИ или мутеина 72. Культуру супернатанта анализируют на ревертазную активность через 2, 4, 6, 8 и 10 дней после инфицирования (табл. 7). Табл. 6 и 7 показывают, что влияние 72 мутеина было особенно заметным. Отрицательный контроль Пример 10. Для определения влияния одного СЛПИ, лролифирацию клетки Н-9 оценивают с помощью анализа по вхождению тимидина, используя клетки Н-9 в количестве 200000, культивированные со 100 микрограммами на миллилитр СЛПИ и без СЛПИ. Культуры подвергают импульсной обработке / /,средой, содержащей 2.5 микрокюри меченного тритием тимидина и проводят измерения на 1,2 и 3 сутки. Как показано в табл. 8, СЛПИ не является токсичным для этих клеток. Таблица 8 Активность(ср. число импульсов в минуту) Пролиферация Н-9 Контроль (-СЛПИ) Стандартное отклонение СЛПИ 100 мкг/мл Стандартное отклонение 3137 1 Пример 11. Изучают также ингибирование продуцирования вируса из хронически инфицированных клеток, используя линию (колонию) промоноцитной клетки 1. Суспензию культуры 1 поддерживают вс 10 и 200 микрограммами на литр гентамицина. Клетки собирают, промывают и суспендируют с плотностью 2,5 миллиона клеток на миллилитр. Суспендированные клетки культивируют в течение ночи в среде,содержащей 100 или 200 микрограмм на миллилитр СЛПИ (имеется в виду какая-то одна среда). Вирус индуцируют добавлением 13-форбол-12-миристат ацетата (РМА) с конечной концентрацией 1 микромоль. Спустя 48 часов супернатант культуры клетки анализируют на ревертазную активность как в примерах 4-9. Как показано в таблице 9, СЛПИ значительно ингибирует продуцирование вируса из этих хронически инфицированных клеток. Таблица 9 Приведенное выше описание приводится с целью иллюстрации и объяснения. Должно быть понятно, что могут быть проведены различные модификации в рамках объема изобретения. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 8