Способ диагностики опухолевого роста и определения типа опухоли

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ОПУХОЛЕВОГО РОСТА И ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИПА ОПУХОЛИ(71) Заявитель Институт физиологии Национальной Академии наук Беларуси(73) Патентообладатель Институт физиологии Национальной Академии наук Беларуси(57) Способ диагностики опухолевого роста и установления типа опухоли, включающий анализ крови и определение в ней антигенов, отличающийся тем, что в сыворотке крови и тканевых жидкостях опухоленосителей определяют ассоциацию факторов, включающих иммунный комплекс, специфический для данной опухоли комплекс свободных антигенов, при анализе в качестве тест-изоантисывороток используют содержащие соответствующий специфическому антигенному комплексу данной опухоли набор антител изоантисывороток, полученных у опухоленосителей с полностью хирургически удаленной у них гомологичной опухолью.(56) 1.1802323, МПК 01 33/53, 1993. Изобретение относится к медицине, а именно к онкологии. Известен способ диагностики опухолевого роста и установления типа опухоли, включающий анализ крови и определение в ней антигенов 1. Однако, этот способ не позволяет точно установить тип злокачественной опухоли. Задачей изобретения является повысить точность диагностики опухолевого роста на любом его этапе и определить тип опухоли. Поставленная задача достигается тем, что в способе диагностики опухолевого роста и установления типа опухоли, включающим анализ крови и определение в ней антигенов, в сыворотке крови и тканевых жидкостях опухоленосителей определяют ассоциацию факторов, включающих иммунный комплекс, специфический для данной опухоли комплекс свободных антигенов, при анализе в качестве тест-изоантисывороток используют содержащие соответствующий специфическому антигенному комплексу данной опухоли набор антител изоантисывороток, полученных у опухоленосителей с полностью хирургически удаленной у них гомологичной опухолью. Разработанный нами способ диагностики рака осуществляется следующим образом 1. Получаем аналитические тест-изоантисыворотки от опухоленосителей с полностью хирургически удалнными опухолями разного типа (А, В и т.д.), содержащие набор антител, соответствующий специфическому для разного типа опухолей (А, В и т.д.) набору антигенов, и контрольные сыворотки от интактных (здоровых) индивидов. Прививаем под кожу подошвенной поверхности задней лапки каждой мыши (2-х - 3-х месячного возраста) по 1106 клеток соответствующей опухоли типа А, В и т.д. Когда опухоль достигнет величины 955 мм,на лапку между голенью и стопой накладываем лигатуру и стопу с опухолью удаляем, культю смазываем йодом. Через 13-21 день после удаления опухоли у мышей под эфирным наркозом путм рассечения аксиллярного сосудистого сплетения получаем кровь и из не сыворотку по обычной методике. Аналогичным методом получаем контрольную сыворотку у интактных (здоровых) мышей. Во всех используемых при анализе сыворотках сыворотка мышей с растущей опухолью (СО), сыворотка мышей с полностью хирургически удалнной опухолью (СУО), сыворотка интактных (здоровых) мышей (ИС) определяем исходное количество иммунных комплексов (ИК) с помощью 3,5 полиэтиленгликоля (ПЭГ 6000) по стандартной методике. Определяем также 2489 1 количество образующегося преципитата при добавлении 3,5 ПЭГ 6000 к экстрактам 110 из опухолей типа А, В и т.д. В полученных изоантисыворотках у мышей с полностью хирургически удалнной опухолью (СУО) типа А, В и т.д. определяем наличие антител против специфического набора антигенов, соответствующего опухоли типа А, В и т.д. с помощью реакции между СУО (А, В и т.д.) с соответствующим каждой опухоли в отдельности экстрактом из опухолевых клеток 110 - ЭО (А, В и т.д.). Для получения содержащей специфический для каждого типа опухоли комплекс антигенов ЭО клетки опухоли типа А, В и т.д. растираем в ступке с кварцевым песком на холоде (4 С), затем добавляем физиологический раствор Хенкса в соответствии 110, перемешиваем, выдерживаем в холодильнике 2 часа, надосадок центрифугируем при 3000 об / мин. 30 мин, а затем час при 105 000 . К части сыворотки СУО (А, В и т.д.), полученной от каждой мыши в отдельности, добавляем в соотношении 11 (0,1 мл 0,1 мл или 0,05 мл 0,05 мл) соответствующего экстракта - ЭО (А, В и т.д.) 110, перемешиваем, смесь выдерживаем в термостате час при 37 С. По стандартной методике определяем количество образующихся иммунных комплексов (для контроля проводим реакцию между сыворотками интактных, здоровых индивидов-мышей и экстрактом опухолей разного типа (А, В и т.д.). При взаимодействии между сывороткой интактных мышей и экстрактом из опухолей при добавлении 3,5 ПЭГ 6000 не образуется дополнительное количество преципитата, превышающее исходный уровень (количество преципитата, образующегося при добавлении 3,5 ПЭГ 6000 к интактной сыворотке и соответствующему экстракту из опухоли 110). При наличии противоопухолевых антител в СУО при взаимодействии (реакции) ее с экстрактом из соответствующей опухоли при добавлении 3,5 ПЭГ 6000 количество образующегося преципитата обычно на 19- 60(средние по разным опытам) превышает исходный уровень ПЭГ-преципитата в этой сыворотке (при анализе из суммарной величины ПЭГ-преципитата, образующегося при реакции, вычитаем величину ПЭГ-преципитата экстракта из опухоли). СУО каждого типа опухоли от отдельных мышей, содержащие противоопухолевые антитела, соединяем и используем как тест-изоантисыворотки СУО (анти А), СУО (анти В) и т.д. 2. Определяем наличие опухолевого роста и типа опухоли в организме опухоленосителя. Получаем исследуемую сыворотку опухоленосителя. Мышам прививаем под кожу спины по 6106 клеток, допустим, опухоли А. Начиная с 5-го для после прививки опухоли до терминальной стадии опухолевого роста (в любой период) получаем кровь у мышей-опухоленосителей путм рассечения аксиллярного сосудистого сплетения или из орбитального синуса, из не готовим по обычной методике сыворотку (исследуемая сыворотка) - сыворотка опухоленосителя (СО). Получаем сыворотку у здоровых (интактных) мышей(СИ). С помощью 3,5 ПЭГ 6000 в сыворотках опухоленосителей и интактных животных (используя часть сыворотки) определяем наличие и количество иммунных комплексов (ИК). Если есть опухоль, в предполагаемой сыворотке опухоленосителей количество нативных ИК в 1,5-1,8 раза (на 50 - 70 ) должно быть выше количества ИК у интактных (здоровых) животных. Этот признак важен, но не обязателен (при опухолевом росте может быть отсутствие повышенного количества ИК, но повышенное количество комплекса свободных антигенов при опухолевом росте всегда имеет место и является обязательным признаком опухолевого роста). С использованием тест-сывороток СУО (анти А), СУО (анти В) и т.д. определяем наличие в исследуемой сыворотке опухоленосителя комплекса свободных опухолевых антигенов и его специфичность - соответствие определнному типу опухоли по образованию ИК при реакции СО и СИ с СУО(анти А), СУО (анти В) и т.д. и добавлении 3,5 ПЭГ 6000. Для этого к единице объма исследуемой сыворотки (СО и СИ) добавляем в соотношении 11 СУО (анти А), СУО(анти В) и т.д. Выдерживаем час при 37 С в термостате, затем с помощью 3,5 ПЭГ 6000 определяем количество ИК, образующихся при проведении иммунологической реакции. Необходимые серии при проведении диагностических реакций 1. СОСУО (анти А) 2. СОСУО (анти В) и т.д. 3. СИСУО (анти А) 4. СИСУО (анти В) и т.д. При проведении реакции в случае, если СО получена от опухоленосителя и у него опухоль типа А, то при проведении указанной реакции получатся следующие результаты Количество ИК, образующихся при реакции СОСУО (анти А), СУО (анти В) и т.д. будет в 2-5 раз превосходить количество ИК, образующихся при взаимодействии СИ с СУО (анти А), (анти В) и т.д. Количество ИК, образующихся при реакции СО с гомологичной ей СУО (анти А) будет в 2-3 раза выше,чем при реакции с негомологичной СУО (анти В) и т.д. Количество ИК, образующихся при реакции СО с СУО (анти А), СУО (анти В) и т.д. будет в 1,3- 2 раза выше, по сравнению с количеством нативных ИК в СО. Причм при реакции СО с гомологичной СУО (анти 2489 1 А) оно превышено в 2 раза (на 84,6 - 93,3 ). При реакции СО с негомологичными СУО (анти В) и т.д. оно будет выше в 1,3- 1,5 раза или на 33 - 50 . На основании вышеизложенного таким образом устанавливается наличие и тип опухоли в организме, а также осуществляется прогнозирование опухолевого роста при изучении изменения количества нативных иммунных комплексов и свободных опухолевых антигенов (если таковые обнаружены) в динамике, так как тврдо установлено, что при прогрессивном опухолевом росте количество ИК выше интактного контроля, но остатся на одном уровне, а количество специфического для опухоли комплекса свободных антигенов возрастает, при отсутствии опухоли (в результате е удаления) снижаются, а затем исчезают в сыворотке крови иммунные комплексы и полностью исчезают свободные опухолевые антигены и появляются противоопухолевые антитела. Примеры Определение наличия опухолевого роста и типа опухоли АКЭ или АГ 22 а у мышей. Получаем аналитические тест-изоантисыворотки от мышей-носителей асцитной карциномы Эрлиха(АКЭ) и асцитной гепатомы 22 а (АГ 22 а) с полностью хирургически удалнными опухолями и сыворотку интактных (здоровых) мышей. Мышам прививаем под кожу подошвенной поверхности задней лапки по 1106 клеток АКЭ или АГ 22 а. Когда опухоль достигает величины 9 х 5 х 5 мм, на лапку между голенью и стопой накладываем лигатуру и стопу с опухолью удаляем под эфирным наркозом. Через 13-21 день после удаления опухоли под эфирным наркозом путм рассечения аксиллярного сосудистого сплетения получаем кровь и из не сыворотку. Получаем сыворотку у интактных (здоровых) животных. Во всех используемых сыворотках(сыворотки мышей с растущей опухолью - АКЭ и АГ 22 а-, сыворотки мышей с удалнной АКЭ и АГ 22 а СУО (АКЭ) и СУО(АГ 22 а), сыворотка здоровых мышей) определяем исходное количество иммунных комплексов с помощью 3,5 ПЭГ 6000. Определяем количество образующегося преципитата при добавлении 3,5 ПЭГ 6000 к экстрактам из АКЭ и АГ 22 а 110. Определяем наличие антител против специфического набора антигенов соответствующего опухолям АКЭ и АГ 22 а типа с помощью реакции между СУО (АКЭ) и СУО (АГ 22 а) и соответствующим каждой опухоли в отдельности экстрактом из опухолевых клеток 110. Для получения содержащего специфический для каждой опухоли комплекс антигенов экстракта (ЭО) клетки АКЭ и АГ 22 а растираем в ступке с кварцевым песком на холоде (4 С), затем добавляем физиологический раствор Хенкса в соотношении 110, перемешиваем, выдерживаем в холодильнике 2 часа, надосадок центрифугируем при 3000 об/мин 30 мин, а затем час при 105 000(экстракт можно хранить в холодильнике при - 20 С). К части сыворотки СУО (АКЭ) или СУО (АГ 22 а), полученной от каждой мыши в отдельности, добавляем в соотношении 11 (0,1 мл 0,1 мл или 0,05 мл 0,05 мл) соответствующий экстракт ЭО (АКЭ) или ЭО(АГ 22 а), перемешиваем. Смесь выдерживаем в термостате час при 37 С. По стандартной методике определяем количество образующихся иммунных комплексов (для контроля проводим реакцию между сывороткой здоровых мышей и экстрактом из опухолей АКЭ и АГ 22 а). При взаимодействии между сывороткой интактных мышей и экстрактом из опухолей при добавлении ПЭГ 6000 (3,5) не образуется дополнительное количество преципитата, превышающее исходный уровень (количество преципитата, образующегося при добавлении 3,5 ПЭГ 6000 к интактной сыворотке и соответствующему экстракту из опухоли). При наличии противоопухолевых антител в СУО (АКЭ) и СУО (АГ 22 а) при реакции их с экстрактами из опухолевых клеток ЭО (АКЭ) и ЭО (АГ 22 а) при добавлении 3,5 ПЭГ 6000 количество образующегося ПЭГ-преципитата в среднем на 27 превышает исходный уровень преципитата в этой сыворотке (при анализе из суммарной величины ПЭГ-преципитата, образующегося при реакции, вычитают величину ПЭГпреципитата экстракта из опухоли). Сыворотки СУО (АКЭ) и СУО (АГ 22 а) отдельных мышей, содержащие противоопухолевые антитела анти-АКЭ и анти-АГ 22 а, соединяем и используем для диагностики (анализа) как тест-изоантисыворотки СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22 а). Получаем исследуемые сыворотки опухоленосителей. Мышам прививаем по 6106 клеток АКЭ или АГ 22 а под кожу спины. Через 10 дней после прививки опухоли (средний вес АКЭ - 1,130,01 г АГ 22 а - 1,250,13 г) у мышей получаем кровь из аксиллярного сплетения или орбитального синуса, готовим исследуемую сыворотку. Получаем для контроля сыворотку интактных (здоровых) мышей (СИ). С помощью 3,5 ПЭГ 6000 в сыворотке опухоленосителя и интактных мышей (используя часть сыворотки) определяем наличие и количество нативных иммунных комплексов. У интактных мышей количество ИК (в ед. оптической плотности) в сыворотке - 0,017. У мышей с АКЭ - 0,026 (превышение контрольного уровня в 1,5 раза или на 53 ). У мышей с АГ 22 а количество ИК - 0,030, что превышает контрольный уровень в 1,8 раза или на 76 . С помощью имеющегося набора тест-изоантисывороток - СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22 а) определяем в исследуемой сыворотке опухоленосителя наличие комплекса свободных опухолевых антигенов и его специфичность - соответствие типу опухоли (АКЭ или АГ 22 а) по образованию ИК при реакции исследуемой сыворотки опухоленосителя и сыворотки интактных индивидов (СИ) с СУО (анти-АКЭ) и СУО (антиАГ 22 а) и добавлении 3,5 ПЭГ 6000. Для этого к единице объма исследуемой сыворотки опухоленосителя (СО) и СИ добавляем в соотношении 11 СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22 а). Смесь выдерживаем час 2489 1 при 37 С в термостате, затем с помощью 3,5 ПЭГ 6000 определяем количество ИК, образующихся при проведении иммунологической реакции. Пример 1. Определяем наличие опухолевого роста и типа опухоли (АКЭ) у мышей-опухоленосителей. Необходимые серии исследования 1. Сыворотка опухоленосителя - СО (АКЭ) СУО (анти-АКЭ). 2. Сыворотка опухоленосителя - СО (АКЭ) СУО (анти-АГ 22 а). 3. Сыворотка интактных мышей - СИСУО (анти-АКЭ). 4. Сыворотка интактных мышей - СИСУО (анти-АГ 22 а). Результаты реакций 1. Количество иммунных комплексов в интактной сыворотке - 0,017. 2. Количество нативных иммунных комплексов в сыворотке опухоленосителя АКЭ - 0,026 на 34(в 1,5 раза) превышает контрольный уровень в СИ. 3. Количество ИК при реакции СО (АКЭ)СУО (анти-АКЭ) - 0,048 в 2 раза (или на 84,6 ) превышает исходный уровень нативных ИК в сыворотке опухоленосителя (серия 1). 4. Количество ИК при реакции СО (АКЭ)СУО (анти-АГ 22 а) - 0,039 в 1,5 раза (на 50 ) превышает исходный уровень нативных иммунных комплексов в сыворотке опухоленосителя (серия 2). 5. Количество ИК при реакции СИСУО (анти-АКЭ) - 0,020 - превышает исходный уровень ИК в СИ на 17,6 (или в 1,1 раза) - серия 3. 6. Количество ИК при реакции СИСУО (анти-АГ 22 а) - 0,021 превышает исходный уровень ИК в СИ на 23,5 (или в 1,2 раза) - серия 4. Выводы и заключения Вывод 1 а). Количество ИК, образующихся при реакции СО (АКЭ) с СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22 а), в 2-5 раз превосходит количество ИК, образующихся при взаимодействии СИ с СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22 а). б). Количество ИК, образующихся при реакции СО (АКЭ) с СУО (анти-АКЭ) и СУО (анти-АГ 22 а) в 1,52 раза выше, по сравнению с количеством нативных ИК в сыворотке опухоленосителя при реакции СО(АКЭ) с гомологичной СУО (анти-АКЭ) превышение на 84,6, при реакции СО (АКЭ) с негомологичной СУО (анти-АГ 22 а) - превышение на 50 . Заключение 1 повышенное количество в СО (АКЭ) нативных иммунных комплексов, по сравнению с интактным контролем, а также повышенное количество свободных опухолевых антигенов (указано в пунктах а и б) свидетельствует о наличии опухолевого роста в организме, у которого получена СО. Вывод 2 Количество ИК, образующихся при реакции СО (АКЭ) с гомологичной ей СУО (анти-АКЭ), в 2 раза больше количества ИК, образующихся при реакции СО (АКЭ) с негомологичной ей СУО (анти-АГ 22 а). Заключение 2 в организме, у которого получена сыворотка (СО), происходит рост АКЭ, а не АГ 22 а. Пример 2. Определяем наличие опухолевого роста и типа опухоли (АГ 22 а) у мышей-опухоленосителей. Необходимые серии исследований 1. Сыворотка опухоленосителя - СО (АГ 22 а)СУО (анти-АГ 22 а). 2. Сыворотка опухоленосителя - СО (АГ 22 а)СУО (анти-АКЭ). 3. Сыворотка интактных мышей - СИСУО (анти-АГ 22 а). 4. Сыворотка интактных мышей - СИСУО (анти-АКЭ). Результаты исследования (реакций) 1. Количество ИК в интактной сыворотке - 0,017. 2. Количество нативных иммунных комплексов в сыворотке опухоленосителей АГ 22 а - 0,030 на 76(в 1,8 раза) превышает контрольный (у СИ) уровень в ИК. 3. Количество ИК при реакции СО (АГ 22 а)СУО (анти-АГ 22 а) - 0,058 в 2 раза (или на 93) превышает исходный уровень ИК в сыворотке опухоленосителей - СО (АГ 22 а)- (серия 1). 4. Количество ИК при реакции СО (АГ 22 а)СУО (анти-АКЭ) - 0,040 в 1,3 раза (на 33 ) превышает исходный уровень нативных иммунных комплексов в сыворотке опухоленосителя - СО (АГ 22 а) -(серия 2). 5. Количество ИК при реакции СИСУО (анти-АГ 22 а) - 0,021 превышает исходный уровень ИК в СИ на 23,5(или в 1,2 раза) - серия 3. 6. Количество ИК при реакции СИСУО (анти-АКЭ) - 0,020 превышает исходный уровень ИК в СИ на 17,6 (или в 1,1 раза), серия 4. Выводы и заключения Вывод 1 а). Количество ИК, образующихся при реакции СО (АГ 22 а) с СУО (анти-АГ 22 а) и СУО (анти-АКЭ), в 24 раза превосходит количество ИК, образующихся при взаимодействии СИ с СУО (анти-АГ 22 а) и СУО (анти-АКЭ). 4 2489 1 б). Количество ИК, образующихся при реакции СО (АГ 22 а) с СУО (анти-АГ 22 а) и СУО (анти-АКЭ) в 1,3-2 раза выше, по сравнению с количеством нативных ИК в сыворотке опухоленосителя - СО (АГ 22 а) при реакции СО (АГ 22 а) с гомологичной СУО (анти-АГ 22 а) превышение на 93 , при реакции СО (АКЭ) с негомологичной СУО (анти-АКЭ) - превышение на 33 . Заключение 1 повышенное количество в СО (АГ 22 а) нативных ИК, по сравнению с интактным контролем, а также повышенное количество свободных опухолевых антигенов (указано в пунктах а и б) свидетельствует о наличии опухолевого роста в организме, у которого получена СО. Вывод 2 Количество ИК, образующихся при реакции СО (АГ 22 а) с гомологичной ей СУО (анти-АГ 22 а) в 3 раза больше количества ИК, образующихся при реакции СО (АГ 22 а) с негомологичной ей СУО (анти-АКЭ). Заключение 2 в организме, у которого получена СО, происходит рост АГ 22 а, а не АКЭ. Исследования, подтверждающие возможность осуществления изобретения (экспериментальные исследования) выполнены в Институте генетики и цитологии АНБ. Для разработки адаптированного к клинике метода иммунодиагностики опухолей в основу настоящего исследования была положена идея использовать антитела (противоопухолевые изоантисыворотки) животных(людей) с полностью хирургически удалнной опухолью для обнаружения в сыворотке опухоленосителей компонента онкотолерогенной ассоциации факторов (10 - 12) - специфического для данной опухоли комплекса свободных антигенов. Возможность использования в клинических условиях противоопухолевых тестизоантисывороток (антител), полученных у больных после полного хирургического удаления растущей опухоли, в диагностических целях, если иметь набор таких сывороток против разного типа опухолей, не представляет большого труда и какой-либо опасности. Для сравнения параллельно с этими опытами были проведены опыты по изучению образования иммунных комплексов (выявлению специфического для опухоли комплекса антигенов) при взаимодействии тех же сывороток опухоленосителей с противоопухолевыми изоантисыворотками, полученными иммунизацией мышей, убитыми облучением опухолевыми клетками. Опыты проведены на мышах линиидвухмесячного возраста, асцитной карциноме Эрлиха и асцитной гепатоме 22 а. Получаем изоантисыворотку у мышей с удалнной опухолью. Для этого прививаем клетки АКЭ или АГ 22 а под кожу подошвенной поверхности стопы задней лапки по 1 млн. опухолевых клеток на мышь. Когда опухоль достигает размеров 955 мм, ступню лапки ампутируем с предварительным наложением лигатуры на голень. На 13 и 21 дни после удаления опухоли у мышей получаем сыворотку. Определяем наличие в сыворотке нативных иммунных комплексов и наличие противоопухолевых антителпо образованию ИК при реакции сыворотки мышей с удалнной опухолью и экстрактом (опухолевый антиген - специфический для опухоли комплекс антигенов) из соответствующих опухолевых клеток 110 (центрифугирование 1 час при 105 000 ). ИК определяем с помощью 3,5 ПЭГ 6000. В исследовании используем те сыворотки мышей с удалнной опухолью, в которых обнаружены противоопухолевые антитела. В случае асцитной карциномы Эрлиха таких образцов сывороток (содержащих противоопухолевые антитела) было 10 из 14, в случае асцитной гепатомы 22 а -12 из 16. Иммунные противоопухолевые сыворотки анти-АКЭ и анти-АГ 22 а получаем иммунизацией мышей линиипутм внутрибрюшинного введения по 6 млн. убитых облучением 12 000 Р клеток АКЭ или АГ 22 а пятикратно с интервалом через 3 дня на 4-ый. Антисыворотку (кровь) получаем у мышей на 10 день после последней иммунизации. Противоопухолевые антитела в ней определяем с помощью содержащего опухолевые антигены экстракта из опухолевых клеток по описанной методике. Часть полученных сывороток мышей с удалнной опухолью (СУО), содержащих противоопухолевые антитела (АнтиСУО) и иммунных противоопухолевых сывороток, полученных иммунизацией убитыми опухолевыми клетками, подвергаем абсорбции соответствующими опухолевыми клетками-мишенями, против которых в сыворотке имелись антитела. Опухолевые клетки-мишени, используемые для абсорбции, обрабатываем 0,25 раствором трипсина 30 мин при комнатной температуре. После этого добавляем к смеси 0,1 - 0,2 мл мышиной сыворотки, перемешиваем. Трипсин удаляем центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин, клетки отмываем раствором Хенкса. Затем к антисыворотке добавляем трипсинизированные опухолевые клетки из расчта 20 млн. опухолевых клеток на 1 мл сыворотки АнтиСУО. Суспензию перемешиваем, инкубируем час при 37 С, затем клетки удаляем центрифугированием 5 мин при 1000 об/мин. Абсорбцию проводим дважды. Абсорбированную сыворотку используем в качестве контрольной при проведении реакций. Прививаем мышам линиипод кожу спины по 6 млн. клеток АКЭ или АГ 22 а. Через 12 дней после прививки опухолей у мышей получаем кровь из аксиллярного сосудистого сплетения (сыворотка опухоленосителя - СО). Определяем в ней количество нативных ИК путм осаждения их 3,5 ПЭГ 6000. Вес опухолей у мышей в это время составлял АКЭ 1,130,09 г., АГ 22 а - 1,250,13 г. 2489 1 Для выявления специфического для опухоли комплекса антигенов в сыворотке опухоленосителей проводим иммунологические реакции между ними и сыворотками, содержащими противоопухолевые антитела (и соответствующими контрольными сыворотками) АнтиСУО (АКЭ или АГ 22 а) и АнтиС (АКЭ или АГ 22 а). Условные обозначения сывороток 1.(АКЭ) - сыворотка мышей-носителей АКЭ. 2. СО (АГ 22 а) - сыворотка мышей-носителей АГ 22 а. 3. СУО (анти-АКЭ) - сыворотка мышей с удалнной АКЭ. 4. СУО (анти-АГ 22 а) - сыворотка мышей с удалнной АГ 22 а. 5. СУО (анти-АКЭ) абс. - сыворотка СУО (анти-АКЭ), абсорбированная клетками АКЭ. 6. СУО (анти-АГ 22 а) абс. - сыворотка СУО (анти-АГ 22 а), абсорбированная клетками АГ 22 а. 7. С (анти-АКЭ) - сыворотка анти-АКЭ, полученная путм иммунизации мышей опухолевыми клетками,убитыми облучением. 8. С (анти-АГ 22 а) - сыворотка анти-АГ 22 а, полученная путм иммунизации мышей опухолевыми клетками, убитыми облучением. 9. С (анти-АКЭ) абс. - сыворотка анти-АКЭ, абсорбированная клетками АКЭ. 10. С (анти-АГ 22 а) абс. - сыворотка анти-АГ 22 а, абсорбированная клетками АГ 22 а. 11. С (инт) - сыворотка интактных мышей. В проведенных исследованиях получены следующие результаты. Установлено, что количество нативных иммунных комплексов в исследуемых сыворотках (в ед. опт. пл.,280 нм)СУО (анти-АКЭ) - 0,050 СУО (анти-АГ 22 а) 0,032 С (анти-АКЭ) - 0,040 С (анти-АГ 22 а) - 0,030 СУО (анти-АКЭ) абс. - 0,048 СУО (анти-АГ 22 а) абс. - 0,032 С (анти-АКЭ) абс. - 0.029 С (анти-АГ 22 а) абс. - 0,026. При реакции сыворотки мышей-носителей АКЭ - СО (АКЭ) - с сывороткой мышей с удалнной опухолью - СУО(анти-АКЭ) прирост количества ИК составил 84,6 , что приблизительно в 7 раз выше прироста количества иммунных комплексов, наблюдаемого при реакции между СО (АКЭ) и абсорбированной сывороткой - СУО (анти-АКЭ) абс.(прирост количества ИК на 11,5), табл.1. Значительно меньший (в 2,5 раза) прирост количества иммунных комплексов наблюдается при взаимодействии сыворотки носителей АГ 22 а с СУО (анти-АКЭ) (прирост на 33,3 ). Значительно более низкий прирост количества иммунных комплексов при взаимодействии сыворотки интактных мышей с СУО(анти-АКЭ) (на 17,6 ), что практически соответствует количеству ИК, образующихся при взаимодействии сыворотки опухоленосителей с сывороткой СУО (анти-АКЭ) абс. При взаимодействии сыворотки мышей с растущей АГ 22 а с сывороткой мышей, у которых полностью удалена эта опухоль - СУО (антиАГ 22 а) - происходит значительный, выраженный прирост количества образующихся ИК, на 93,3 , что в 5 раз больше, чем количество ИК, образующихся при взаимодействии сыворотки мышейопухоленосителей СО (АГ 22 а) с абсорбированной сывороткой мышей с удалнной опухолью (прирост ИК на 20) и сыворотки интактных мышей с СУО (анти-АГ 22 а) - прирост на 23,5 , табл.2. При реакции СО (АКЭ) с сывороткой мышей с удалнной АГ 22 а - СУО (анти-АГ 22 а) - отмечен также прирост количества ИК на 50 , но он в 1,9 раза ниже, чем прирост при взаимодействии сыворотки мышей-носителей АГ 22 а с сывороткой мышей с полностью удалнной АГ 22 а. Таким образом, указанные эксперименты показывают, что сыворотки мышей-опухоленосителей реагируют иммунологически с сыворотками мышей, у которых полностью хирургически удалена растущая опухоль, при этом образуется количество иммунных комплексов значительно, в 5-7 раз превышающее фоновый (контрольный) уровень образующихся иммунных комплексов. В перекрстных реакциях между сыворотками опухоленосителей генотипически различных опухолей и негомологичными им сыворотками мышей с полностью удалнной опухолью также образуется значительное количество иммунных комплексов, но оно в 2- 2,5 раза меньше, чем количество иммунных комплексов, образующихся при взаимодействии (реагировании) гомологичных сывороток мышей-опухоленосителей и сывороток мышей с удалнной опухолью. Эти данные показывают, как и полученные нами ранее с противоопухолевыми антисыворотками, что используемые опухоли имеют общие антигены в свом специфическом антигенном наборе и различные антигены. Это свидетельствует о том, что, имея набор гомологичных сывороткам опухоленосителей сывороток индивидуумов с удалнной опухолью, можно обнаружить и отдифференцировать любую опухоль и установить наличие опухолевого роста в любом его периоде. Проведенные параллельные исследования с использованием противоопухолевых антисывороток антиАКЭ и анти-АГ 22 а, полученных иммунизацией мышей убитыми облучением опухолевыми клетками, показали полную идентичность эффекта этих иммунных сывороток и сывороток, полученных у мышей после полного хирургического удаления у них опухоли, при их взаимодействии с сыворотками опухоленосителей, идентичность по их способности выявлять в сыворотке опухоленосителей специфический для опухоли комплекс присутствующих в ней свободных опухолевых антигенов. 2489 1 Из табл. 3 видно, что при реагировании сыворотки мышей-носителей АКЭ - СО (АКЭ) - с гомологичной антисывороткой - С (анти-АКЭ) - количество образующихся при этом иммунных комплексов увеличивается на 76,9 , что в 5 раз выше количества ИК, образующихся при взаимодействии СО (АКЭ) с абсорбированной иммунной сывороткой (прирост ИК на 15,4 ) и в 7 раз выше количества ИК, образующихся при взаимодействии иммунной противоопухолевой сыворотки с интактной (прирост ИК на 11,8 ). Аналогичные результаты получаем при взаимодействии сыворотки мышей-носителей АГ 22 а - СО (АГ 22 а) - с иммунной сывороткой С (анти-АГ 22 а). При этом количество ИК увеличивается на 63,3 , что в 5 раз выше количества ИК, образующихся при взаимодействии СО (АГ 22 а) с С (анти-АГ 22 а) абс. (прирост ИК на 13,3), и в 2 раза выше количества ИК, образующихся при взаимодействии интактной сыворотки с иммунной С (анти-АГ 22 а) - прирост на 35,3 , табл. 4. Прирост количества иммунных комплексов (преципитатов) при взаимодействии иммунных сывороток и содержащих противоопухолевые антитела сывороток мышей с полностью удалнной опухолью с интактными сыворотками обусловлен наличием в интактных сыворотках комплемента, присутствие которого и взаимодействие с ИК, имеющимися в используемых тест-сыворотках, способствует образованию молекулярных агрегатов, которые при добавлении 3,5 ПЭГ обусловливают образование повышенного количества ПЭГ-преципитатов, что не имеет отношения к специфической иммунологической реакции между опухолевыми антигенами и противоопухолевыми антителами. Таким образом, указанными исследованиями убедительно показана возможность с помощью противоопухолевых антител набора изологичных антисывороток мышей (больных) с полностью хирургически удалнной опухолью (а не полученных иммунизацией введением убитых опухолевых клеток, которая в клинических условиях неприемлема) на любом этапе роста опухоли установить присутствие в сыворотке опухоленосителей специфического для данной опухоли комплекса свободных опухолевых антигенов и тем самым установить как наличие (или отсутствие) опухолевого роста на любом его этапе, так и отдифференцировать любую опухоль при наличии набора антисывороток животных (больных) с полностью хирургически удалнными различными по гистогенезу (морфологии) опухолями. Таблица 1 Количество в сыворотке опухоленосителей специфического для опухоли комплекса (СОК) антигенов,выявляемых реакций с СУО (анти-АКЭ) Количество СОК антигенов (количество ИК после реакции без нативных ИК в СУО превышения над количеством нативных ИК в сыворотке исследуемых мышей (опухоленосителей или интактных) 84,6 11,5 33,3 17,6 2489 1 Таблица 2 Количество в сыворотке опухоленосителей специфического для опухоли комплекса (СОК) антигенов,выявляемых реакций с СУО (анти-АГ 22 а) Количество животных Количество СОК антигенов (коли-чество ИК после реакции без нативных ИК в СУО (анти-АГ 22 а) и СУО (антиАГ 22 а) абс. превышения над количеством нативных ИК в сыворотке исследуемых мышей Таблица 3 Количество в сыворотке опухоленосителей специфического для опухоли комплекса (СОК) антигенов,выявляемых реакций с С (анти-АКЭ) Количество СОК антигенов (количество ИК после реакции без нативных ИК в С (антиАКЭ) и С (анти-АКЭ) абс. 0,0260,001 0,0460,002 0,0300,001 0,0170,001 0,0190,001 превышения над количеством нативных ИК в сыворотке исследуемых мышей (опухоленосителей или интактных) 76,9 15,4 11,8 Количество в сыворотке опухоленосителей специфического для опухоли комплекса (СОК) антигенов,выявляемых реакций с С (анти-АГ 22 а) Количество СОК антигенов (количество ИК после реакции без нативных ИК в С (анти-АГ 22 а) и С (анти-АГ 22 а) абс. 0,0300,001 0,0490,002 0,0340,001 0,0170,001 0,0230,001 Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 8 превышения над количеством нативных ИК в сыворотке исследуемых мышей (опухоленосителей или интактных) 63,3 13,3 35,3