Способ профилактики мастита у сухостойных коров и нетелей

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ МАСТИТА У СУХОСТОЙНЫХ КОРОВ И НЕТЕЛЕЙ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Богуш Александр Александрович Бородич Людмила Марьяновна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2116085 1, 1998. БОГУШ А.А. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак почета государственная академия ветеринарной медицины,2009. - Т. 45. - Вып. 2. - Ч. 1. - С. 153-154.4591499, 1986.3984575, 1976.2058781 1, 1996.2272627 1, 2006.2301663 1, 2007.2004121621 , 2006.9392 1, 2007.(57) Способ профилактики мастита у сухостойных коров и нетелей, включающий внутрицистернальное введение антимаститного препарата, отличающийся тем, что препарат вводят в дозе 5 см 3 во все четверти вымени коровам на 2-3 сутки сухостоя и за 10-15 суток до предполагаемого отела, нетелям - за 10-15 суток до предполагаемого отела, а в качестве препарата используют культуры штаммов- 352 - Д и- 1190 - Д в соотношении 11 с общим количеством лактобацилл не менее 107 /см 3. Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано для профилактики мастита у сухостойных коров и нетелей. Известны способы профилактики субклинического мастита у сухостойных коров путем внутрицистернального введения рифациклина П, мастисана А, Б, Е, нафпензала ДС,аэродита, орбенина ДС, орбенина , дифурола А, Б, мастицида-2, апромаста, гелиомаста,ристомаста, дифумаста, фурадина, мультимаста ДС, диофура, диеномаста, тетрамаста,эроксимаста 1, 2. Недостатком вышеуказанных способов профилактики мастита является использование для этой цели антибиотиков, оказывающих отрицательное действие не только на механизм локальной защиты молочной железы, но и на иммунную систему организма в целом. Контактируя с антибиотиками основные возбудители мастита у коров приобретают устойчивость к ним, что вовсе не сопровождается снижением их патогенности, вирулентности, токсиногенности. 15182 1 2011.12.30 Новым направлением в профилактике мастита у сухостойных коров и нетелей является применение пробиотических препаратов, действующим веществом которых являются пробиотические штаммы микроорганизмов, которые выступают в качестве антагонистов возбудителей мастита. Пробиотические микроорганизмы в процессе своей жизнедеятельности продуцируют целый ряд биологически активных соединений антимикробные вещества белковой природы - бактериоцины, основные классы биосурфактантов - нейтральные липиды, фосфолипиды и гликолипиды, аминокислоты, ферменты, лизоцим, молочную кислоту, низин и лактоцидин, диплококцин, ацидолин, лактобациллин, булгарин, ацидофилин, лактоцидин. Экзометаболиты пробиотических микроорганизмов, входящие в состав нормальной микрофлоры, оказывают положительное влияние на бактериальный биоценоз,обмен веществ и иммунную систему макроорганизма 3, 4. Известен способ профилактики мастита у коров в период сухостоя, включающий внутрицистернальное введение лекарственных препаратов в инфицированные четверти вымени. В качестве таких препаратов используются стафилококковый анатоксин или стафилококковый анатоксин со стрептококковым анатоксином в дозе 0,9-1 мл каждый 5. Недостатком данного способа является то, что стрептококковый и стафилококковый анатоксины содержат в своем составе 0,2-0,3 формалина и, во избежание раздражающего действия на ткани молочной железы, препараты предварительно разводят физиологическим раствором 11, что значительно затрудняет процесс проведения профилактических мероприятий. Кроме того, данный способ неэффективен при других видах патогенных микроорганизмов. Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности профилактики мастита у сухостойных коров и нетелей. Поставленная задача достигается тем, что в способе профилактики мастита у сухостойных коров и нетелей, включающем внутрицистернальное введение антимаститного препарата, препарат вводят в дозе 5 см 3 во все четверти вымени коровам на 2-3 сутки сухостоя и за 10-15 суток до предполагаемого отела, нетелям - за 10-15 суток до предполагаемого отела, а в качестве препарата используют культуры штаммов- 352 - Д и- 1190 - Д в соотношении 11 с общим количеством лактобацилл не менее 107 КОЕ/см 3. Заявляемое изобретение позволяет повысить эффективность профилактики мастита у сухостойных коров и нетелей. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент выделен в 2001 году из бактериального концентрата для силоса. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент депонирован в коллекции РУП Институт мясо-молочной промышленности, и ему присвоен номер 1190- Д. Таксономическая принадлежность.относится к семейству , родуи виду. Культурально-морфологические признаки штамм- 1190 Д - штамм-продуцент при окраске по Грамму имеет вид коротких палочковидных,правильной формы, попарно сцепленных или цепочек грамположительных клеток, не образующих капсул и спор. Физиолого-биохимические признаки. Хемоорганотрофы. Факультативный анаэроб,растет в средеи ПГС при оптимальной температуре 322 С. На плотной питательной среде образует мелкие круглые колонии, глубинные колонии лодочкообразной формы. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент обладает метаболизмом бродильного типа, сбраживает широкий спектр углеводов, за исключением арабинозы, раффинозы, с образованием -молочной кислоты, газ из глюкозы не образует,не образует диацетил, ацетоин и индол, желатин не разжижает, нитрат не восстанавливает,аргинин не гидролизует, каталазоотрицательный, устойчив к 6 соли, обладает сильны 2 15182 1 2011.12.30 ми кислотообразовательными свойствами (время образования сгустка при внесении 3-5 инокулята - 6,0 ч), предельная кислотность в молоке достигает 210, образует сгусток плотной консистенции. Антимикробные свойства. Штамм- 1190 - Д - штаммпродуцент проявляет антимикробные свойства в отношении(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 22 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 21 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 20 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 15 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 20 мм) (табл. 2). Чувствительность к антибиотикам. Штамм- 1190 - Д штамм-продуцент высокочувствителен к карбенициллину, цефалексину, фурадонину,рифампицину, тетрациклину, стрептомицину, меропенему, цефоперазону, эритромицину,цефотаксиму, доксициклину, бензилпенициллина натриевой соли (зоны задержки роста микроорганизма составляют 26-40 мм), умеренно чувствителен к фурагину, сизомицину,олеандомицину, левомицетину, ломефлоксацину, азитромицину (зоны задержки роста микроорганизма составляют 15-25 мм), малочувствителен к норфлоксацину, неомицину,канамицину (зоны задержки роста микроорганизма составляют менее 15 мм), микроорганизм устойчив к бацитрацину, цефиксиму, полимиксину и ванкомицину (отсутствие зон задержки роста микроорганизма) (табл. 1). Условия хранения. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент хранится после лиофильного высушивания в ампулах в течение 10 лет при температуре-1840 С. Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные среды с содержанием 0,2 агара 1 раз в месяц при условии хранения при температуре 42 С. Штамм- 352 - Д - штамм-продуцент выделен в 2001 г. из Вологодской закваски мезофильных палочек (из пищеварительного тракта крупного рогатого скота). Штамм- 352 - Д - штамм-продуцент депонирован в коллекции РУП Институт мясо-молочной промышленности и ему присвоен номер 352, родуи виду. Культурально-морфологические признаки штамм- 352 Д - штамм-продуцент при окраске по Грамму имеет вид длинных палочек (длиной от 3 до 40 мкм, толщиной 1,5-1 мкм) правильной формы, одиночных и соединенных попарно. Клетки не подвижны, не образуют спор и капсул, грамположительны. Физиолого-биохимические признаки. Хемоорганотрофы. Факультативный анаэроб,растет в средеи ПГС при оптимальной температуре 372 С. На плотных питательных средах образует колонии поверхностные - светлые, локонообразные, глубинные - в виде паучков. Штамм- 352 - Д - штамм-продуцент обладает метаболизмом бродильного типа, сбраживает широкий спектр углеводов за исключением арабинозы, мелецитозы, мелибиозы, раффинозы, рибозы, сорбита с образованием -молочной кислоты, газ из глюкозы не образует, не образует диацетил, ацетоин и индол, желатин не разжижает, нитрат не восстанавливает, аргинин не гидролизует, каталазоотрицательный,устойчив к 2 соли, обладает сильными кислотообразовательными свойствами (время образования сгустка при внесении 3-5 инокулята - 3,5 ч), предельная кислотность в молоке достигает 390 , образует сгусток вязкой консистенции. Антимикробные свойства. Штамм- 352 - Д - штаммпродуцент проявляет антагонистические свойства в отношении(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 24 мм),3(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 22 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 18 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 14 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 16 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 12 мм) (табл. 2). Чувствительность к антибиотикам. Штамм- 352 - Д штамм-продуцент высокочувствителен к карбенициллину, цефиксиму, цефалексину, фурадонину, фурагину, тетрациклину, стрептомицину, олеандомицину, меропенему, левомицетину, цефоперазону, азитромицину, ванкомицину, эритромицину, цефотаксиму,доксициклину, бензилпенициллина натриевой соли (зоны задержки роста микроорганизма составляют 26-40 мм), умеренно чувствителен к бацитрацину, рифампицину, сизомицину,неомицину, канамицину (зоны задержки роста микроорганизма составляют 15-25 мм), малочувствителен к норфлоксацину (зоны задержки роста микроорганизма составляют менее 15 мм), микроорганизм устойчив к полимиксину и ломефлоксацину (отсутствие зон задержки роста микроорганизма) (табл. 1). Условия хранения. Штамм-352 - Д - штамм-продуцент хранится после лиофильного высушивания в ампулах в течение 10 лет при температуре-1840 . Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные среды с содержанием 0,2 агара 1 раз в месяц, при условии хранения при температуре 42 С. Таблица 1 Чувствительность штаммов-352 - Д-штаммпродуцент и-1190 - Д-штамм-продуцент к антибиотикам Зона задержки роста тестируемого Содержание микроорганизма, мм противоНазвание диска микробного- 352- 1190 Д - штамм- - Д - штаммвещества продуцент продуцент Диски с карбенициллином 25 мкг 40 38 Диски с бацитрацином 10 ЕД 20 Диски с цефиксимом 5 мкг 40 Диски с цефалексином 30 мкг 40 26 Диски с фурадонином 300 мкг 32 28 Диски с фурагином 300 мкг 34 23 Диски с рифампицином 5 мкг 22 30 Диски с сизомицином 10 мкг 23 17 Диски с тетрациклином 30 мкг 31 26 Диски с стрептомицином 300 мкг 41 31 Диски с полимиксином 300 ЕД Диски с олеандомицином 15 мкг 31 18 Диски с норфлоксацином 10 мкг 12 14 Диски с неомицином 30 мкг 21 13 Диски с меропенемом 10 мкг 51 30 Диски с левомицетином 30 мкг 32 20 Диски с ломефлоксацином 10 мкг 15 Диски с цефоперазоном 75 мкг 44 26 Диски с азитромицином 15 мкг 35 20 Диски с ванкомицином 30 мкг 32 Диски с эритромицином 15 мкг 46 36 4 Продолжение табл. 1 Зона задержки роста тестируемого микроорганизма, мм- 352- 1190 Д - штамм- - Д - штаммпродуцент продуцент 18 12 38 36 44 34 Диски с канамицином 30 мкг Диски с цефотаксимом 30 мкг Диски с доксициклином 10 мкг Бензилпенициллина 1000000 ЕД 40 40 натриевая соль Примечания к таблице а) задержки роста нет (-) - микроорганизмы устойчивы к данному препарату б) задержка роста до 15 мм - микроорганизмы малочувствительны в) задержка роста от 15 до 25 мм - чувствительны г) задержка роста более 25 мм - микроорганизмы высокочувствительны. Таблица 2 Антимикробные свойства штаммов- 352 - Д штамм-продуцент и- 1190 - Д - штамм-продуцент в отношении патогенных микроорганизмов Зоны задержки роста патогенных микроорганизмов, мм- Д - штамм-продуцент Примечания к таблице а) задержки роста нет (-) - патогенные микроорганизмы устойчивы к штаммуантагонисту б) задержка роста до 15 мм - патогенные микроорганизмы малочувствительны к штаммуантагонисту в) задержка роста от 15 до 25 мм - патогенные микроорганизмы чувствительны к штамму-антагонисту г) задержка роста более 25 мм - патогенные микроорганизмы высокочувствительны к штамму-антагонисту. Препарат, используемый в заявляемом способе, представляет собой жидкость в виде суспензии от темно-соломенного до коричневого цвета с легкоразбивающимся осадком,запах слабый, специфический кисломолочный. Препарат, используемый в заявляемом способе, не содержит консервантов и красителей. Пример 1. Способ получения препарата для профилактики мастита у сухостойных коров и нетелей включает выращивание штаммов-продуцентов лактобацилл на питательной среде. В качестве штаммов-продуцентов используют лиофилизированную культуру- 352 - Д - штамм-продуцент и лиофилизированную культуру-1190 - Д-штамм-продуцент, которые восстанавливают по от 5 15182 1 2011.12.30 дельности параллельно на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, пептон, хлорид натрия, -цистеин, твин, агар, глюкозу и воду дистиллированную. Восстановление осуществляют при температуре от 36 до 38 С для- 352 - Д - штамм-продуцент и при температуре от 32 до 34 С для- 1190 - Д - штамм-продуцент в течение 16-20 часов. Затем восстановленные штаммы- 352 - Д штамм-продуцент и- 1190 - Д - штамм-продуцент используют для получения посевного материала путем внесения их по отдельности параллельно в 500-700 см 3 питательной среды в количестве 1-5 от объема питательной среды и культивируют при температуре от 36 до 38 С для 352 - Д - штамм-продуцент и при температуре от 32 до 34 С для- 1190 - Д - штамм-продуцент в течение 16-20 часов. Затем вносят посевной материал каждого штамма-продуцента лактобацилл по отдельности параллельно в молочную сыворотку, содержащую 5-40 -ного раствора глюкозы, в следующем соотношении 7-10 посевного материала- 352 - Д - штаммпродуцент от общего объема препарата,7-10 посевного материала- 1190 - Д - штаммпродуцент от общего объема препарата,80-86 молочной сыворотки от общего объема препарата. Дальше накапливают бактериальную массу при температуре от 36 до 38 С для- 352 - Д - штамм-продуцент и при температуре от 32 до 34 С для- 1190 - Д - штамм-продуцент в течение 16-20 часов,затем охлаждают накопленную бактериальную массу каждого штамма-продуцента до температуры от 8 до 12 С и смешивают бактериальную массу каждого штаммапродуцента в соотношении 11, устанавливают значение 6,0-6,5 и охлаждают до температуры от 2 до 6 С. Причем питательная среда включает компоненты при следующем соотношении панкреатический гидролизат казеина - 20 г. дрожжевой экстракт - 5 г пептон - 5 г хлорид натрия - 2 г-цистеин - 0,1 г твин - 1 мл агар - 0,15 г глюкоза - 30 г вода дистиллированная - до 1 литра. Пример 2. Для профилактики мастита у сухостойных коров были проведены исследования на 40 животных. Было сформировано 4 группы животных по 10 голов в каждой 1 - сухостойные коровы (вводили препарат, используемый в заявляемом способе,внутрицистернально в дозе 10 см 3 однократно в реагирующие на пробу с беломастином четверти и в дозе 5 см 3 в отрицательно реагирующие на пробу с беломастином четверти вымени после запуска на 2-3 сутки и затем повторно за 15 суток до предполагаемого отела) 2 - сухостойные коровы (вводили препарат, используемый в заявляемом способе,внутрицистернально в дозе 5 см 3 в реагирующие на пробу с беломастином четверти и в дозе 3 см 3 в отрицательно реагирующие на пробу с беломастином четверти вымени двукратно с интервалом 24 часа после запуска на 2-3-и сутки сухостоя и затем повторно за 15 суток до предполагаемого отела) 3 - сухостойные коровы (вводили внутрицистернально Мастисансогласно инструкции по применению) 4 - сухостойные коровы (чистый контроль - препараты не вводились). Внутрицистернальное введение препаратов проводилось с соблюдением правил асептики (предварительная обработка сосков 70 раствором спирта, использовались стериль 6 Препарат, используемый в заявляемом способе,в дозе 10 см 3 однократно в реагирующие четверти и в дозе 5 см 3 в отрицательно реагирующие четверти вымени после запуска на 2-3 сутки и затем повторно за 15 суток до предполагаемого отела Препарат, используемый в заявляемом способе,в дозе 5 см 3 в реагирующие четверти и в дозе 3 см 3 в отрицательно реагирующие четверти вымени двукратно с интервалом 24 часа после запуска на 2-3 сутки сухостоя и затем повторно за 15 суток до предполагаемого отела Мастисансогласно инструкции по применению Препараты не вводились Количество реагирующих на тест с беломастином четвертей вымени Количество четвертей вымени, подвергшихся обработке ные шприцы с пластмассовыми насадками) после сдаивания секрета из молочной железы. Учет результатов проводили через 10-12 суток после введения препарата и затем через 710 суток после отела. Результаты представлены в табл. 3. Таблица 3 Результаты сравнения при профилактике мастита у сухостойных коров согласно заявляемому способу при внутрицистернальном введении препарата, используемого в заявляемом способе, и используемого базового препарата МастисанИз них дали отрицательную реакцию Как следует из табл. 3, при внутрицистернальном введении сухостойным коровам препарата, используемого в заявляемом способе, в дозе 10 см 3 однократно в реагирующие четверти и в дозе 5 см 3 в отрицательно реагирующие четверти вымени после запуска на 2-3-й день и затем повторно за 15 дней до предполагаемого отела терапевтическая эффективность составляет 82,1 сухостойным коровам с субклиническим маститом - в дозе 5 см 3 в реагирующие четверти и в дозе 3 см 3 в отрицательно реагирующие четверти вымени двукратно с интервалом 24 часа после запуска на 2-3-й день сухостоя и затем повторно за 15 дней до предполагаемого отела - 81,5 в базовом варианте при субклиническом мастите у сухостойных коров при применении Мастисанатерапевтическая эффектив 7 15182 1 2011.12.30 ность составляет 75 у животных 4-й группы (контрольная) заболеваемость сухостойных коров субклиническим маститом увеличилась с 75,0 до 85,0 . В ходе испытаний осложнений и противопоказаний у коров не зарегистрировано. Пример 3. Для профилактики мастита у нетелей были проведены исследования на 30 животных. Было сформировано 3 группы животных по 10 голов в каждой 1 - опытная (вводили препарат, используемый в заявляемом способе, в дозе 5 см 3 в каждую четверть вымени за 15 дней до предполагаемого отела) 2 - опытная (вводили препарат, используемый в заявляемом способе, в дозе 10 см 3 в каждую четверть вымени за 15 дней до предполагаемого отела) 3 - контрольная (препарат не вводился). Внутрицистернальное введение препарата проводили с соблюдением правил асептики(предварительная обработка сосков 70 спиртом, использовались стерильные шприцы с пластмассовыми насадками) с последующим массажом соска снизу вверх. Учет результатов профилактической обработки проводили через 7-10 дней после отела беломастиновой пробой. Результаты представлены в табл. 4. Таблица 4 Результаты профилактической обработки нетелей при внутрицистернальном введении препарата, используемого в заявляемом способегруппы Количество Маститный тест с беломастином в опыте Положительный Сомнительный Отрицательный четвертей нетелей четвертей четвертей четвертей вымени вымени вымени вымени Опытная 1 10 40 1 2,5 3 7 36 90 Опытная 2 10 40 1 2,5 2 5 37 92,5 Контрольная 10 40 7 17,5 6 15 27 67,5 Как следует из табл. 4, увеличение дозы препарата, используемого в заявляемом способе, в 2 раза (с 5 до 10 см 3) не дало преимуществ. Источники информации 1. Методические указания по диагностике, лечению и профилактике маститов у коров утв. ГУВ с государственной ветеринарной и государственной продовольственной инспекциями Минсельхозпрода РБ 04.11.06. - Минск РНИУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского Национальной академии наук Беларуси, 2006. - 26 с. 2. Методические рекомендации по диагностике, терапии и профилактике субклинического мастита у коров в сухостойный период рассмотрены и одобрены секцией Патология, фармакология и терапия Россельхозакадемии (протокол 1 от 24 марта 2005 г.). Воронеж ГНУ Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии, 2005. - 11 с. 3. Говрилова Н, Ратникова И.А. Создание пробиотиков для лечения социально значимых инфекций // Клиническое питание, 2007. -1, 2. - С. А 32. 4. Красочко П.А., Красочко И.А., Машеро В.А. и др. Использование пробиотиков для профилактики заболеваний желудочно-кишечного тракта и терапии животных Метод. рекомендации. - Витебск УО ВГАВМ, 2006. - 86 с. 5. Патент 2116085, МПК 6 А 6139/085, 39/09, 1998 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8