Способ лечения субклинического или клинического мастита у лактирующих коров

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ СУБКЛИНИЧЕСКОГО ИЛИ КЛИНИЧЕСКОГО МАСТИТА У ЛАКТИРУЮЩИХ КОРОВ(71) Заявитель Республиканское научноисследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Богуш Александр Александрович Бородич Людмила Марьяновна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56)2012342 1, 1994. БОГУШ А.А. и др. Ученые записки учреждения образования Витебская ордена Знак почета государственная академия ветеринарной медицины,2009. - Т. 45. - Вып. 2. - Ч. 1. - С. 153-154.4591499, 1986.3984575, 1976.1813445 1, 1993.94026123 1, 1996.94005986 1, 1995.2070409 1, 1996.1684981 , 1995.(57) Способ лечения субклинического или клинического мастита у лактирующих коров,включающий внутрицистернальное введение антимаститного препарата, отличающийся тем, что коровам с субклиническим маститом препарат вводят в дозе 5 см 3 в пораженную четверть вымени с интервалом 12 часов в течение 3-4 суток, коровам с клиническим маститом катаральной формы или гнойно-катаральной формы препарат вводят в дозе 5 см 3 в пораженную четверть вымени с интервалом 12 часов в течение 4 суток и, при необходимости,спустя 12-14 суток курс повторяют, при этом в качестве препарата используют культуры штаммов- 352 - Д и- 1190 - Д в соотношении 11 с общим количеством лактобацилл не менее 107 /см 3. Изобретение относится к сельскому хозяйству, в частности к ветеринарии, и может быть использовано для профилактики и лечения субклинического и клинического мастита у лактирующих коров. Известны способы профилактики и лечения субклинического и клинического мастита у лактирующих коров путем введения через канал соска мастисана - А, Б, Е, мастидина,пенэрсина и др. 1. Недостатки данных способов лечения субклинического и клинического мастита у коров заключаются в том, что антибиотики, сульфаниламиды, входящие в состав препаратов,раздражают ткани молочной железы, угнетают местную резистентность, нарушают естественный биоценоз молочной железы, что ведет к развитию дисбактериоза, частому рецидивированию патологического процесса. В течение длительного времени компоненты 15181 1 2011.12.30 препаратов (антибиотики, сульфаниламиды) выделяются с молоком, что создает угрозу здоровью людей. Новым направлением в лечении субклинического и клинического мастита у лактирующих коров является применение микроорганизмов в качестве антагонистов возбудителей мастита и иммуностимуляторов как местных защитных механизмов молочной железы,так и всего организма животного. С целью лечения субклинического и клинического мастита у коров предложен способ, включающий внутрицистернальное введение антимаститного препарата, причем в качестве антимаститного препарата используют смесь лиофилизата термофильного стрептококка штамма 2 КС, обезжиренного молока с 6,26,5, содержащего 1 глюкозы и воды 2. Недостатком этого способа лечения мастита у лактирующих коров является сравнительно низкая эффективность, нечувствительность других возбудителей мастита. Задачей настоящего изобретения является повышение эффективности профилактики и лечения мастита у лактирующих коров. Поставленная задача достигается тем, что в способе лечения субклинического или клинического мастита у лактирующих коров, включающем внутрицистернальное введение антимаститного препарата, коровам с субклиническим маститом препарат вводят в дозе 5 см 3 в пораженную четверть вымени с интервалом 12 часов в течение 3-4 суток, коровам с клиническим маститом катаральной формы или гнойно-катаральной формы препарат вводят в дозе 5 см 3 в пораженную четверть вымени с интервалом 12 часов в течение 4 суток и, при необходимости, спустя 12-14 суток курс повторяют, при этом в качестве препарата используют культуры штаммов- 352 - Д и- 1190 - Д в соотношении 11 с общим количеством лактобацилл не менее 107 КОЕ/см 3. Заявляемое изобретение позволяет повысить эффективность лечения и профилактики субклинического и клинического мастита у лактирующих коров. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент выделен в 2001 году из бактериального концентрата для силоса. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент депонирован в коллекции РУП Институт мясо-молочной промышленности и ему присвоен номер 1190- Д. Таксономическая принадлежность.относится к семейству , родуи виду. Культурально-морфологические признаки штамм- 1190 Д - штамм-продуцент при окраске по Грамму имеет вид коротких, палочковидных,правильной формы, попарно сцепленных или цепочек грамположительных клеток, не образующих капсул и спор. Физиолого-биохимические признаки. Хемоорганотрофы. Факультативный анаэроб,растет в средеи ПГС при оптимальной температуре 322 С. На плотной питательной среде образует мелкие круглые колонии, глубинные колонии лодочкообразной формы. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент обладает метаболизмом бродильного типа, сбраживает широкий спектр углеводов за исключением арабинозы, раффинозы с образованием -молочной кислоты, газ из глюкозы не образует, не образует диацетил, ацетоин и индол, желатин не разжижает, нитрат не восстанавливает,аргинин не гидролизует, каталазоотрицательный, устойчив к 6 соли, обладает сильными кислотообразовательными свойствами (время образования сгустка при внесении 3-5 инокулята - 6,0 ч), предельная кислотность в молоке достигает 210 Т, образует сгусток плотной консистенции. Антимикробные свойства. Штамм- 1190 - Д - штаммпродуцент проявляет антимикробные свойства в отношении(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 22 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 21 мм),(зона 2 15181 1 2011.12.30 задержки роста патогенного микроорганизма составляет 20 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 15 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 20 мм) (табл. 2). Чувствительность к антибиотикам. Штамм-1190 - Д штамм-продуцент высокочувствителен к карбенициллину, цефалексину, фурадонину,рифампицину, тетрациклину, стрептомицину, меропенему, цефоперазону, эритромицину,цефотаксиму, доксициклину, бензилпенициллина натриевой соли (зоны задержки роста микроорганизма составляют 26-40 мм), умеренно чувствителен к фурагину, сизомицину,олеандомицину, левомицетину, ломефлоксацину, азитромицину (зоны задержки роста микроорганизма составляют 15-25 мм), малочувствителен к норфлоксацину, неомицину,канамицину (зоны задержки роста микроорганизма составляют менее 15 мм), микроорганизм устойчив к бацитрацину, цефиксиму, полимиксину и ванкомицину (отсутствие зон задержки роста микроорганизма) (табл. 1). Условия хранения. Штамм- 1190 - Д - штамм-продуцент хранится после лиофильного высушивания в ампулах в течение 10 лет при температуре-18-40 С. Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные среды с содержанием 0,2 агара 1 раз в месяц, при условии хранения при температуре 42 С. Штамм- 352 - Д - штамм-продуцент выделен в 2001 г. из Вологодской закваски мезофильных палочек (из пищеварительного тракта крупного рогатого скота). Штамм- 352 - Д - штамм-продуцент депонирован в коллекции РУП Институт мясо-молочной промышленности и ему присвоен номер 352 - Д. Таксономическая принадлежность.относится к семейству, родуи виду. Культурально-морфологические признаки штамм- 352 Д - штамм-продуцент при окраске по Грамму имеет вид длинных палочек (длиной от 3 до 40 мкм, толщиной 1-1,5 мкм) правильной формы, одиночные и соединенные попарно. Клетки неподвижны, не образуют спор и капсул, грамположительны. Физиолого-биохимическиепризнаки. Хемоорганотрофы. Факультативный анаэроб,растет в средеи ПГС при оптимальной температуре 372 С. На плотных питательных средах образует колонии поверхностные - светлые, локонообразные, глубинные в виде паучков. Штамм- 352 - Д - штамм-продуцент обладает метаболизмом бродильного типа, сбраживает широкий спектр углеводов за исключением арабинозы, мелецитозы, мелибиозы, раффинозы, рибозы, сорбита с образованием -молочной кислоты, газ из глюкозы не образует, не образует диацетил, ацетоин и индол, желатин не разжижает, нитрат не восстанавливает, аргинин не гидролизует, каталазоотрицательный,устойчив к 2 соли, обладает сильными кислотообразовательными свойствами (время образования сгустка при внесении 3-5 инокулята - 3,5 ч), предельная кислотность в молоке достигает 390 Т, образует сгусток вязкой консистенции. Антимикробные свойства. Штамм- 352 - Д - штаммпродуцент проявляет антагонистические свойства в отношении(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 24 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 22 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 18 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 14 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 16 мм),(зона задержки роста патогенного микроорганизма составляет 12 мм) (табл. 2). Чувствительность к антибиотикам. Штамм- 352 - Д штамм-продуцент высокочувствителен к карбенициллину, цефиксиму, цефалексину, фурадонину, фурагину, тетрациклину, стрептомицину, олеандомицину, меропенему, лево 3 15181 1 2011.12.30 мицетину, цефоперазону, азитромицину, ванкомицину, эритромицину, цефотаксиму, доксициклину, бензилпенициллина натриевой соли (зоны задержки роста микроорганизма составляют 26-40 мм), умеренно чувствителен к бацитрацину, рифампицину, сизомицину,неомицину, канамицину (зоны задержки роста микроорганизма составляют 15-25 мм), малочувствителен к норфлоксацину (зоны задержки роста микроорганизма составляют менее 15 мм), микроорганизм устойчив к полимиксину и ломефлоксацину (отсутствие зон задержки роста микроорганизма) (табл. 1). Условия хранения. Штамм-352 - Д - штамм-продуцент хранится после лиофильного высушивания в ампулах в течение 10 лет при температуре-18-40 С. Жизнеспособность его поддерживается путем пересева на питательные среды с содержанием 0,2 агара 1 раз в месяц, при условии хранения при температуре 42 С. Таблица 1 Чувствительность штаммов- 352 - Д - штамм-продуцент и- 1190 - Д - штамм-продуцент к антибиотикам. Зона задержки роста тестируемого микроорганизма, мм Содержание Название диска микробногоп/п вещества 352 - Д 1190 - Д штамм-продуцент штамм-продуцент 1. Диски с карбенициллином 25 мкг 40 38 2. Диски с бацитрацином 10 ЕД 20 3. Диски с цефиксимом 5 мкг 40 4. Диски с цефалексином 30 мкг 40 26 5. Диски с фурадонином 300 мкг 32 28 6. Диски с фурагином 300 мкг 34 23 7. Диски с рифампицином 5 мкг 22 30 8. Диски с сизомицином 10 мкг 23 17 9. Диски с тетрациклином 30 мкг 31 26 10 Диски с стрептомицином 300 мкг 41 31 11. Диски с полимиксином 300 ЕД 12. Диски с олеандомицином 15 мкг 31 18 13. Диски с норфлоксацином 10 мкг 12 14 14. Диски с неомицином 30 мкг 21 13 15. Диски с меропенемом 10 мкг 51 30 16. Диски с левомицетином 30 мкг 32 20 17. Диски с ломефлоксацином 10 мкг 15 18. Диски с цефоперазоном 75 мкг 44 26 19. Диски с азитромицином 15 мкг 35 20 20. Диски с ванкомицином 30 мкг 32 21. Диски с эритромицином 15 мкг 46 36 22. Диски с канамицином 30 мкг 18 12 23. Диски с цефотаксимом 30 мкг 38 36 24. Диски с доксициклином 10 мкг 44 34 25. Бензилпенициллина натриевая соль 1000000 ЕД 40 40 Примечания к таблице а) задержки роста нет (-) - микроорганизмы устойчивы к данному препарату б) задержка роста до 15 мм - микроорганизмы малочувствительны в) задержка роста от 15 до 25 мм - чувствительны г) задержка роста более 25 мм - микроорганизмы высокочувствительны. 4 15181 1 2011.12.30 Таблица 2 Антимикробные свойства штаммов- 352 - Д штамм-продуцент и- 1190 - Д - штамм-продуцент в отношении патогенных микроорганизмов. Зоны задержки роста патогенных микроорганизмов, мм Тестируемый- Д - штамм-продуцент Примечания к таблице а) задержки роста нет (-) - патогенные микроорганизмы устойчивы к штамму-антагонисту б) задержка роста до 15 мм - патогенные микроорганизмы малочувствительны к штаммуантагонисту в) задержка роста от 15 до 25 мм - патогенные микроорганизмы чувствительны к штамму-антагонисту г) задержка роста более 25 мм - патогенные микроорганизмы высокочувствительны к штамму-антагонисту. Пример 1. Способ получения препарата для лечения субклинического или клинического мастита у лактирующих коров включает выращивание штаммов-продуцентов лактобацилл на питательной среде - в качестве штаммов-продуцентов используют лиофилизированную культуру- 352 - Д - штамм-продуцент и лиофилизированную культуру- 1190 - Д - штамм-продуцент, которые восстанавливают по отдельности параллельно на питательной среде, содержащей панкреатический гидролизат казеина, дрожжевой экстракт, пептон, хлорид натрия, -цистеин, твин, агар, глюкозу и воду дистиллированную, восстановление осуществляют при температуре от 36 до 38 С для- 352 - Д - штамм-продуцент и при температуре от 32 до 34 С для- 1190 - Д - штамм-продуцент в течение 16-20 часов, затем восстановленные штаммы- 352 - Д штамм-продуцент и- 1190 - Д - штамм-продуцент используют для получения посевного материала путем внесения их по отдельности параллельно в 500-700 см 3 питательной среды в количестве 1-5 от объема питательной среды и культивируют при температуре от 36 до 38 С для- 352 - Д штамм-продуцент и при температуре от 32 до 34 С для 1190 - Д - штамм-продуцент в течение 16-20 часов, затем вносят посевной материал каждого штамма-продуцента лактобацилл по отдельности параллельно в молочную сыворотку, содержащую 540 -ного раствора глюкозы, в следующем соотношении 7-10 посевного материала- 352 - Д - штамм-продуцент от общего объема препарата,7-10 посевного материала- 1190 - Д - штамм-продуцент от общего объема препарата,80-86 молочной сыворотки от общего объема препарата,дальше накапливают бактериальную массу при температуре от 36 до 38 С для- 352 - Д - штамм-продуцент и при температуре от 32 до 34 С для- 1190 - Д - штамм-продуцент в течение 16-20 часов, затем охлаждают накопленную бактериальную массу каждого штамма-продуцента до температуры от 8 до 12 С и смешивают бактериальную массу каждого штаммапродуцента в соотношении 11, устанавливают значение 6,0-6,5 и охлаждают до температуры от 2 до 6 С. 5 15181 1 2011.12.30 Причем питательная среда включает следующее соотношение компонентов панкреатический гидролизат казеина - 20 г,дрожжевой экстракт - 5 г,пептон - 5 г,хлорид натрия - 2 г,-цистеин - 0,1 г,твин - 1 мл,агар-0,15 г,глюкоза - 30 г,вода дистиллированная до 1 литра. Пример 2. Для изучения раздражающих свойств препарата, применяемого при заявляемом способе, на молочную железу коров провели исследования на 10 здоровых коровах в сравнении с базовым препаратом мастисан А. Животные дали отрицательную реакцию на скрытые маститы при постановке беломастиновой пробы и пробы отстаивания. Подопытным коровам (5 голов) внутрицистернально вводили препарат в дозе 5 см 3 трехкратно с интервалом 24 часа, а контрольным (5 голов) - мастисан-А согласно наставлению. Введение препаратов проводили в передние четверти вымени. О действии препарата на ткани молочной железы судили по наличию (отсутствию) местной воспалительной реакции, изменению органолептических свойств молока, изменению содержания соматических клеток в молоке, которое определяли по методу Прескотта-Брида в следующие сроки до введения и через 24, 48, 72 часа и спустя 7 суток после последнего введения препаратов. Таблица 3 Количество соматических клеток в молоке после применения заявляемого препарата, используемого в заявляемом способе, и мастисана А Количество соматических клеток в 1 см 3 молока Наименование препарата После введения До введения 24 ч 48 ч 72 ч 7 суток Препарат, используемый 234600 493680 375360 297840 240720 в заявляемом способе 23260 38517,66 34044 31833 22486 Мастисан А 261120 1105680 911880 765000 301920 12325 93127,73 69449,94 70594,02 34829 В результате проведенных исследований установлено, что клиническое состояние животных опытной и контрольной групп после введения препаратов не изменилось. Молочная железа сохраняла мягкую консистенцию и была безболезненной. Молоко выдаивалось из вымени легко и не имело отклонений в органолептических показателях. Содержание соматических клеток в молоке через 24 часа после введения препарата увеличилось с 234600 до 493680 в 1 см 3, а после введения мастисана-А - с 261120 до 1105680 и достигло 301920 только через 7 суток (табл. 3). Пример 3. Для изучения сравнительной терапевтической эффективности заявляемого способа с использованием препарата были сформированы 3 группы лактирующих коров, больных субклиническим маститом, по 10 животных в каждой. Животным первой группы препарат вводился в дозе 5 см 3 восьмикратно (2 раза в сутки с интервалом 12 часов на протяжении 4 дней) животные второй группы подвергнуты четырехкратной обработке препаратом в той же дозе с интервалом 24 часа, животным контрольной группы вводили, согласно наставлению, базовый препарат мастисан А, который наиболее широко используется в ветеринарной практике для лечения коров с этой патологией. Введение препаратов проводили внутрицистернально с соблюдением правил асептики (предварительная обработка сосков 70 спиртом, использовали стерильные шприцы и молочные катетеры) после тщательного сдаивания молока из молочной железы. После введения препарата проводи 6 15181 1 2011.12.30 ли массаж соска снизу вверх. Эффективность мероприятий определяли спустя 10 дней после последнего введения препаратов с помощью диагностикума Беломастин (10 -ный раствор разводили дистиллированной водой в соотношении 13, затем в углубление пластинки МКП-1 вносили по 1,0 см 3 испытуемого молока, после чего добавляли по 1,0 см 3 рабочего раствора диагностикума и перемешивали путем горизонтального вращения). Результат реакции на скрытый мастит учитывали в первые 10-20 секунд-- (отрицательная реакция) жидкая смесь остается однородной- (сомнительная реакция) в смеси образуются слизистые нити- (положительная реакция) смесь приобретает консистенцию слизистой массы или желеобразного сгустка. Результаты лечения приведены в табл. 4. Таблица 4 Результаты лечения лактирующих коров, больных субклиническим маститом,при внутрицистернальном введении препарата, используемого в заявляемом способе, и базового препарата мастисана А Количество Маститный тест с беломастином в опыте Группа Положительный Сомнительный Отрицательный коров Четвертей Коров Четвертей Четвертей Четвертей вымени вымени вымени вымени Опытная 1 10 38 17 44,7 19 50,0 4 10,5 1 2,6 6 15,8 32 84,2 Опытная 2 10 37 21 56,8 15 40,5 1 2,7 2 5,4 14 37,8 21 56,8 Контрольная 10 40 19 47,5 20 50,0 1 2,5 7 17,5 10 25,0 23 57,5 Примечание числитель - результат до опыта знаменатель - результат после опыта. Согласно данным, приведенным в табл. 4, при субклиническом мастите коров оптимальной схемой лечения препаратом, используемым в заявляемом способе, является внутрицистернальное введение препарата в дозе 5 см 3 в течение 4-х дней с интервалом 12 ч терапевтическая эффективность составила 84,2 . В базовом варианте при лечении коров мастисаном А излечено 57,5 . Пример 4. Для изучения эффективности заявляемого способа и препарата, используемого в заявляемом способе, на разные формы мастита был проведен опыт на 64 животных. По результатам диагностики было сформировано 5 групп животных. Введение препарата проводили внутрицистернально по следующей схеме 1 группа - животные с сомнительной реакцией на субклинический мастит, подвергнутые двукратной обработке пробиотическим препаратом с интервалом 24 часа в дозе 5 см 3 2 группа - животные с субклиническим маститом, подвергнутые обработке препаратом шестикратно с интервалом 12 часов в дозе 5 см 3 3 группа - животные с клиническим маститом, подвергнутые обработке восьмикратно с интервалом 12 часов в дозе 5 см 3 спустя 14 суток после последнего введения курс лечения у реагирующих на мастит коров повторили 4 группа - животные с субклиническим маститом, подвергнутые лечению базовым препаратом мастисаном А согласно инструкции по применению препарата 5 группа (контрольная) - животные, здоровые на момент первичной диагностики (препараты не вводились). Внутрицистернальное введение препаратов проводилось с соблюдением правил асептики (предварительная обработка сосков 70 спиртом, использовались стерильные шприцы с пластмассовыми насадками) после тщательного сдаивания молока из молочной 7 15181 1 2011.12.30 железы с последующим массажем соска снизу вверх. Для установления эффективности проведенных мероприятий спустя 10-14 дней после последнего введения препарата проводили повторное диагностическое исследование опытных и контрольной групп коров на наличие мастита в четвертях вымени, подвергнутых лечению. Результаты представлены в табл. 5. Таблица 5 Результаты лечения коров, больных субклиническим и клиническим маститом,при внутрицистернальном введении препарата, используемого в заявляемом способе, и базовым препаратом мастисан А Из них дали Колиотрицательную Состояние Схема лечения чество реакцию групп вымени коров Голов препарат, используемый в заявляемом Сомнительная 1 способе, внутрицистернально, доза 17 17 100 реакция на мастит 5 см 3, двукратно с интервалом 24 ч препарат, используемый в заявляемом Субклинический 2 способе, внутрицистернально, доза 17 16 94,1 мастит 3 5 см , шестикратно с интервалом 12 ч Клинический мастит препарат, используемый в заявляемом(катаральный,способе, внутрицистернально, доза 3 10 9 90 гнойно 5 см 3, два курса лечения с интервалом катаральный) между курсами 1 4 дней Субклинический Мастисан А, внутрицистернально,4 мастит (базовая доза 5 см 3, трехкратно с интервалом 10 9 90 контрольная группа) 24 часа Клинически здоро 5 вые животные (чи- Лечение не проводилось 10 7 70 стый контроль) Как следует из табл. 5, при двукратном внутрицистернальном введении коровам с сомнительной реакцией на мастит препарата, используемого в заявляемом способе, в дозе 5 см 3 с интервалом 24 ч терапевтическая эффективность составляет 100 , коровам с субклиническим маститом в дозе 5 см 3 с интервалом 12 ч шестикратно - 94,1 , коровам с катаральным и гнойно-катаральным клиническими маститами двумя курсами по указанной выше схеме - 90 , в базовом варианте при субклиническом мастите и применении мастисана А - 90 , в четвертой контрольной группе клинически здоровых коров за время опыта заболело маститом 30 животных. В ходе испытаний осложнений и противопоказаний у коров не зарегистрировано. Источники информации 1. Богуш А.А., Каменская Т.Н., Иванов В.Е., Лукьянчик С.А., Бельмач М.М., Бородич Л.М., Конон А.И. Методические указания по диагностике, лечению и профилактике маститов у коров утв. Главным управлением ветеринарии с Государственной ветеринарной и Государственной продовольственной инспекциями Министерства сельского хозяйства и продовольствия Республики Беларусь 04.11.2006. - Минск РНИУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н. Вышелесского НАН Беларуси, 2006. - 25 с. 2.2012342, МПК 561 35/66, 1994 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8