Штамм бактерий Bacillus subtilis, обладающий антагонистической активностью в отношении фитопатогенов овощных культур

ШТАММ БАКТЕРИЙ, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ФИТОПАТОГЕНОВ ОВОЩНЫХ КУЛЬТУР(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Коломиец Эмилия Ивановна Романовская Татьяна Витальевна Чикилева Анна Евгеньевна Здор Наталья Анатольевна Лобанок Анатолий Георгиевич Попов Федор Антонович Сорока Сергей Владимирович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Штамм бактерийБИМ В-334 Д, обладающий антагонистической активностью в отношении фитопатогенов овощных культур. Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии, предназначено для использования в защите овощных культур от болезней и касается нового штамма - основы биопестицида Фитопротектин. Ежегодно ухудшающаяся экологическая ситуация и фитосанитарная нестабильность в Беларуси требует новых идей и подходов к разработке экологически ориентированных систем защиты растений. Одним из направлений оздоровления и стабилизации сельскохозяйственного производства может стать использование методов биологического контроля фитопатогенов и вредителей. Однако отсутствие отечественного производства биопестицидов и высокая стоимость импортируемых препаратов сдерживают применение биометода в республике. Наиболее критическая ситуация создалась в овощеводстве. Ассортимент биологических средств защиты, используемых против возбудителей болезней овощных культур, весьма ограничен - триходермин и импортируемые из России фитолавин-100 (на основе) и бактофит (ИПМ 215) 1. Основной недостаток импортируемых препаратов - высокая стоимость и узкий спектр контролируемых болезней овощных культур. Так, фитолавин-100 применяют преимущественно для борьбы с болезнями капусты и томата. Бактофит в Беларуси разрешен для применения только на одной культуре - огурце - в защищенном грунте против мучнистой 8396 1 2006.08.30 росы и корневых гнилей. Для борьбы с болезнями картофеля и капусты, широко распространенных в республике культур, препарат не используется. Известен штамм 683 - основа отечественного биопрепарата миколин,предназначенного для защиты овощных культур от болезней 2. Он рекомендуется для использования на капусте, моркови и картофеле. В настоящее время осваивается его опытно-промышленное производство. Однако, в соответствии со спектром действия этого препарата, его применение не сможет обеспечить решения проблем, связанных с защитой крестоцветных, томатов, огурцов, салата, щавеля, сахарной свеклы и многих других сельскохозяйственных растений от одного из самых вредоносных заболеваний - ризоктониоза. Известен штаммМ-22-ВИЗР - основа биопрепарата гамаир для защиты растений от бактериозов 3. Основным недостатком указанного штамма является сравнительно невысокая антагонистическая активность к возбудителям болезней овощных культур - бактериям,,и грибам родов , ,(табл. 3). Известен штамм 10-ВИЗР - основа биопрепарата алирин Б фунгицидного действия 4. К недостаткам штамма следует отнести потребность в дорогостоящих источниках питания, таких как кукурузный экстракт, а также высокую продолжительность выращивания (трое суток), что негативно сказывается на экономических показателях ферментационного процесса. Наиболее близким предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является штаммКМБУ 30043 - антагонист фитопатогенных микроорганизмов 5. Данный штамм использован в качестве прототипа. Он ингибирует развитие широкого спектра испытанных микроорганизмов и рекомендуется для комплексной защиты сельскохозяйственных культур от болезней. Недостатками данного штамма являются 1. Отсутствие избирательности действия, штамм подавляет развитие как фитопатогенной, так и полезной бактериальной и грибной почвенной микрофлоры, в частности микроорганизмов, способствующих оздоровлению микробоценозов, таких как,,. Интродукция указанного антагониста может привести к тем же разрушительным для биоценозов последствиям, что и применение химических пестицидов. 2. Вызывает сомнение технологичность штамма и его пригодность для выращивания в производственных условиях по следующим причинам- основу получаемой в процессе глубинной ферментации жидкой культуры составляют не споры, а живые клетки продуцента, что негативно сказывается на качестве биопестицида, его сохранности и эффективности интродукции- глубинное культивирование штамма предусматривает использование дорогостоящего источника углеродного питания - глюкозы, что экономически не выгодно. Задачей изобретения является получение полифункционального штамма с избирательной антагонистической активностью к возбудителям наиболее вредоносных болезней овощных культур и высокой фитостимулирующей активностью, способного к росту и продукции антимикробных метаболитов на относительно дешевых и простых по составу питательных средах. Предлагаемый штаммБИМ В-334 Д выделен из ризосферы томата, депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под регистрационным номером БИМ В-334 Д. Культура также поддерживается в коллекции лаборатории средств биологического контроля ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм хранится при 4 С на мясо-пептонном агаре, рН 6,8-7,2. Культурально-морфологические свойства. При поверхностном культивировании на мясо-пептонном агаре образует круглые колонии сероватого цвета, с ровным краем, 3-5 мм в диаметре, слизистые, приподнятые у 2 8396 1 2006.08.30 молодой культуры и шероховатые, плоские у стареющей. Клетки подвижные, представляют собой палочки бациллярной формы размером 0,81,3-1,6 мкм с округлыми концами. Споры эллипсовидные, расположены центрально или субтерминально. Спорангиум не раздут. Клетки расположены одиночно, в парах или коротких цепочках. Окраска по Граму положительная. Физиолого-биохимические признаки. Облигатный аэроб. Растет при температуре 15-50 С. Оптимум 30-35 С. Отношение к источникам углерода утилизирует глюкозу, сахарозу, галактозу, арабинозу, ксилозу, рамнозу, фруктозу, мальтозу, рафинозу, инозит, сорбит, глицерин, цитрат,лактозу, маннозу разжижает желатину не утилизирует пропионат гидролизует крахмал. Отношение к источникам азота ассимилирует сульфат аммония, нитрат аммония, нитрат калия, мочевину, пептон, кукурузный и дрожжевой экстракт, восстанавливает нитраты до нитритов. Другие особенности характеризуется каталазной активностью, образует ацетоин, не разлагает тирозин, растет на средах Мейнелла, Чапека, в 7 и не способен к росту при 10 концентрации . Штамм не является патогенным и токсикогенным. Токсикологические исследования штамма проводились на белых мышах. Установлено, что штамм при внутреннем и внутрибрюшинном введении его суспензии во всех исследуемых концентрациях от 105 до 1010 не вызывает гибели животных. Отклонений в поведении, поедаемости корма, состоянии шерстного покрова, двигательной активности опытных животных по сравнению с контрольными не выявлено. При введении фильтрата 7-суточной жидкой культурыБИМ В-334 Д подкожно в заднюю лапку в количестве 0,5 мл гибели опытных животных и некроза тканей на месте введения не выявлено. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что штамм может использоваться в микробиологическом производстве. Штамм В.БИМ В-334 Д не фитотоксичен. Фитотоксичность проверяли на растениях редиса. Эта культура является традиционным биотестом, так как обладает наиболее высокой чувствительностью к фитотоксическим препаратам, что обусловлено высокой энергией прорастания его семян и скороспелостью культуры. Для проведения анализа кончики корней (точку роста и меристематическую зону) проростков редиса помещают на 1 ч в культуральную жидкость бактерий. Контрольные проростки помещают в воду и стерильную питательную среду. После этого проростки раскладывают в чашки Петри на влажную фильтровальную бумагу, помещают в термостат (22-24 С) и выдерживают несколько дней. Выявленное отсутствие задержки в развитии, некротических пятен, ожогов и других изменений по сравнению с контролем свидетельствует о нетоксичности бактерий В.БИМ В-334 Д для высших растений. Штамм обладает высокой антагонистической активностью в отношении фитопатогенных грибов родов , , , , ,и бактерий родов , , . Суть предлагаемого изобретения иллюстрируется следующими примерами. Пример 1. Для изучения спектра антимикробной активности В.БИМ В-334 Д используют метод радиальных штрихов. Для этого суспензию клеток антагониста наносят бактериальной петлей на поверхность агаровой среды в центр чашки Петри (диаметром 15 мм). Культуру подращивают в термостате при температуре 30 С в течение суток. Затем радиальными штрихами к сформировавшейся колонии подсевают различные культуры фитопатогенных и сапрофитных грибов и бактерий. Совместное инкубирование проводят при 25-30 С. Характер биотических взаимоотношений антагониста и тест-объектов оценивают через 1-5 суток (табл. 1, 2). 8396 1 2006.08.30 Таблица 1 Спектр антибактериальной активности штамма В.БИМ В-334 Д Виды бактерий фитопатогенныесапрофитные. нет данных Таблица 2 Спектр антигрибной активности штамма В.БИМ В-334 Д Виды грибов фитопатогенные. нет данных нет данных Анализ полученных данных показывает, что исследуемый штамм избирательно ингибирует развитие фитопатогенных грибов и бактерий, не оказывая негативного влияния на полезную микрофлору. Таким образом, преимуществом заявляемого штамма В.БИМ В-334 Д по сравнению с прототипом является выраженная специфичность действия к возбудителям болезней овощных культур, что свидетельствует о перспективности его интродукции в агроэкосистемы для контроля фитопатогенных микроорганизмов. Пример 2. Бактерии В.БИМ В-334 Д выращивают в условиях глубинной ферментации в течение 36-48 ч при 35 С на питательных средах, основу которых составляют соли среды Мейнелла (г/л К 2 НРО 43 Н 2 О - 7,0 КН 2 РО 4 - 3,0 47 Н 2 О - 0,1 (4)24 - 1,5 -цитрат - 0,5), а в качестве источников углерода используют глюкозу или мелассу, как более дешевый сахаросодержащий субстрат. Оценивают титр спор и антагонистическую актив 4 8396 1 2006.08.30 ность к наиболее вредоносным патогенам овощных культур. Согласно полученным данным (табл. 3) заявляемый штамм превосходит известные аналоги по ряду показателей 1. Отличается более высокой антагонистической активностью к возбудителям болезней овощных культур. 2. В условиях глубинного выращивания характеризуется активным спорообразованием, что обеспечивает стабильность получаемого биопрепарата при хранении (пример 3). 3. В отличие от прототипа, для культивирования которого используется глюкоза,В.БИМ В-334 Д способен к росту и продукции антимикробных метаболитов на среде с более дешевым источником углеводного питания - мелассой, отходом свеклосахарного производства. Таблица 3 Показатели роста, спорообразования и антагонистическая активность В.БИМ В-334 Д в сравнении с известными аналогами Штаммы, продолжительность выращивания В.БИМ В.КМБУ В.683 В.Источник углерода В-334 Д 30043 (прототип),(аналог),М-22-ВИЗР 36 ч 5 48 ч 2(аналог), 72 ч 3 36 ч 48 ч Глюкоза Титр, клеток/мл 4109 5109 8107 Доля спор,70-75 88-92 Диаметр зоны иннет данных нет данных нет данных гибирования, мм.31 33 Е.23 25 Меласса Титр, клеток/мл нет данных нет данных 6109 7109 Доля спор,75-80 95-98 90-95 Диаметр зоны иннет данных гибирования, мм.35 37 37 18 Е.26 28 26 24 Пример 3. Для изучения стабильности титра спор и антагонистической активности штамма в процессе хранения культуральную жидкость В.БИМ В-334 Д выдерживают в течение 6 месяцев при температурах 15 и 4 С, периодически отбирая пробы для контроля указанных показателей. Как видно из табл. 4, при температуре 4 С титр и активность бактерий практически не изменяются на протяжении всего наблюдаемого периода. При температуре 15 С споровая культура хранится без существенного изменения исходных показателей в течение 3-х месяцев. В целом можно сделать вывод, что споровая суспензия бактерий В.БИМ В-334 Д даже без добавления консервантов сохраняет свои исходные свойства в течение продолжительного времени - шести месяцев при температуре 4 С и не менее трех месяцев при температуре 15 С. 5 8396 1 2006.08.30 Таблица 4 Изменение титра и антагонистической активности В.БИМ В-334 Д в процессе хранения Диаметр зон задержки роста Условия хранения Титр, спор/мл гриба, мм 9 Исходная КЖ 35,0 7,010 1 месяц 15 С 32,5 5,7109 9 4 С 35,0 6,310 3 месяца 15 С 31,5 4,4109 4 С 34,5 5,9109 6 месяцев 15 С 27,5 1,9109 9 4 С 34,5 5,510 Пример 4. Штамм оказывает положительное действие на посевные качества семян сельскохозяйственных растений. Для оценки влияния В.БИМ В-334 Д на всхожесть семена капусты замачивают в 2 растворе культуральной жидкости антагониста в течение 24 часов. В контрольных вариантах семена замачивают в дистиллированной воде или обрабатывают аналогичным образом препаратами миколин и фитолавин-100. Обработанные семена помещают в чашки Петри по 100 штук. По результатам фитоэкспертизы обработанных семян установлено, что бактерии В.БИМ В-334 Д активизируют процессы прорастания семян, повышая всхожесть на 7-13 по сравнению с контролем, а также снижают пораженность проростков фитопатогенным комплексом на 56,4-84,5(табл. 5). Таблица 5 Влияние В.БИМ В-334 Д на посевные качества семян капусты Вариант опыта В.БИМ В-334 Д Миколин (аналог) Фитолавин-100 (аналог) Контроль (вода) Согласно результатам проведенных исследований, штамм В.БИМ В-334 Д имеет следующие преимущества по сравнению с аналогами характеризуется более высокой (в 1,8 раза) эффективностью фитозащитного действия проявляет более высокую (на 17-24 ) ростстимулирующую активность. Пример 5. Оценка фитозащитного и ростстимулирующего действия В.БИМ В-334 Д в полевых условиях осуществлялась на моркови сорта Лявониха в рассадочный период и период вегетации на опытном поле РУП БелНИИО. Для оздоровления растений семена обрабатывают 2 культуральной жидкостью антагониста. Фитоанализ корнеплодов моркови при уборке показал (табл. 6), что биологическая эффективность культуры в борьбе с черной гнилью ( ) в 2 раза выше эффективности Триходермина (аналог) и составляет 52 . Наряду с защитным действием использование В.БИМ В-334 Д способствует увеличению урожайности корнеплодов. При этом прибавка урожая составляет 44,2 ц/га, против 12,9 ц/га для Триходермина. 6 8396 1 2006.08.30 Таблица 6 Влияние В.БИМ В-334 Д на пораженность болезнями и урожайность моркови Вариант опыта В.БИМ В-334 Д Триходермин-БЛ (аналог) Контроль (без обработки) Пораженность корнеплодов черной гнилью,3,8 6,0 7,9 Таким образом, заявляемый штамм по важнейшим показателям - технологичности,спектру антимикробного действия, ростстимулирующей активности и биологической эффективности - превосходит известные аналоги и может использоваться для защиты овощных культур от болезней. Источники информации 1. Интегрированные системы защиты сельскохозяйственных культур от вредителей,болезней, сорняков Рекомендации / Под ред. В.Ф. Самерсова. - Барановичи Баранов., укрупн. тип., 1998. - С. 469. 2. Патент 4209 С 1, МПК А 01 63/00, 2001. 3. Патент 2084152 С 1, МПК 6 А 01 63/00, С 12 1/20 // (С 12 1/20 // С 12 1125), 1997. 4. Патент 2081167 С 1, МПК 6 С 12 1/20 // (С 12 1/20, С 12 1125) А 01 63/00,1997. 5. Патент 3962 С 1, МПК 01 63/00, 2001 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7