Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля

01 43/00, 07 9/00, 63/00 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ РАЗМНОЖЕНИЯ ОЗДОРОВЛЕННОГО СЕМЕННОГО МАТЕРИАЛА КАРТОФЕЛЯ(71) Заявители Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси Республиканское унитарное предприятие Белорусский научно-исследовательский институт картофелеводства(72) Авторы Бобрик Алла Олеговна Хрипач Владимир Александрович Жабинский Владимир Николаевич Завадская Маргарита Ивановна Литвиновская Раиса Павловна(73) Патентообладатели Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси Республиканское унитарное предприятие Белорусский научно-исследовательский институт картофелеводства(57) Способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля на питательной среде Мурасиге-Скура или на ее модификации, включающих регулятор роста, отличающийся тем, что в качестве регулятора роста используют брассиностероид общей формулы(56) Биотехнологические методы получения и оценки оздоровленного картофеля (Рекомендации). - М. В.О. Агропромиздат, 1988. - С. 16-17.2080780 1, 1997.2114116 1, 1998.96/06529 А 1. Методические указания по оздоровлению семенного картофеля. - Мн. Ураджай, 1986. С. 13-15. Хрипач В.А., Лихвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Мн. Наука и техника, 1993. - С. 242-254. Средства защиты и регуляторы роста растений. Справочное пособие. - Мн., 1995. - С. 75. 5698 1 Изобретение относится к сельскому хозяйству, а именно к способу получения оздоровленного семенного материала картофеля. Известны способы оздоровления семенного материала и отбора растений, свободных от вирусной инфекции и других заболеваний, заключающиеся в предварительном проращивании клубней при повышенной температуре (термотерапия) или вычленении культуры верхушечной меристемы, в которой вирусы, как правило, отсутствуют 1, 2. В целях повышения эффективности оздоровления картофеля от вирусных болезней используют сочетание метода термотерапии с последующим вычленением из проростков верхушечных меристем. Оба метода длительны (4-6 недель) и требуют больших трудо- и энергозатрат (термокамера с температурой 33-37 С и 24-25 С, соответственно, при освещенности 4-8 тыс. люкс в течение 16 ч в сутки). Для тиражирования полученного таким образом исходного семенного материала с целью включения в первичное и элитное семеноводство применяют затем методы размножения на питательных средах, в частности, на среде Мурасиге-Скуга 3, считающейся оптимальной для картофеля. Процесс выращивания черенков происходит в специально оборудованном помещении при температуре 18-20 С, освещении люминесцентными лампами (3-4 тыс. люкс) в течение 16 ч в сутки и также является длительным, трудо- и энергоемким. Наиболее близким к предлагаемому является способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля, при котором в состав питательной среды для выращивания черенков входит набор микро- и макросолей, витамины для полноценного питания растений. Для ускорения роста растений добавляют в питательную среду регуляторы (стимуляторы) роста. Например, с целью стимулирования роста корневой системы и улучшения приживаемости растений добавляют фитогормон из группы ауксинов - индолилуксусную кислоту (ИУК). Рост стеблей индуцируют с помощью гиббереллинов. Для этой же цели применяют аденин, кинетин. При этом, однако, происходит лишь удлинение стебля без увеличения числа междоузлий, т.е. вытягивание клеток. Рост растений до стадии, пригодной к черенкованию, занимает в этом случае не менее 14 дней 3, 4. В настоящее время неизвестны препараты на основе стероидных соединений, которые применяются в сельском хозяйстве для размножения оздоровленного семенного материала картофеля. Задачей настоящего изобретения является способ размножения оздоровленного семенного материала картофеля, позволяющий сократить период роста растений до готовности к черенкованию, увеличить коэффициент размножения при черенковании, увеличить выход растений, свободных от вирусной инфекции, и, как следствие, - сократить энерго- и трудозатраты, затраты времени на единицу продукции. Поставленная задача решается способом, который предусматривает добавление в стандартную питательную среду для микроклонального размножения оздоровленного семенного материала картофеля в качестве регулятора (стимулятора) роста растений фитогормонов класса брассиностероидов общей формулы- Гомобрассинолид,Указанные соединения получены химическим путем, но имеют природное происхождение и широко распространены в природе (считают, что они свойственны всем или абсолютному большинству растительных видов, хотя содержание их в растениях ничтожно 2 5698 1 мало и составляет около 10-5-10-9 ). Они известны как новая группа гормонов растений 5. Один из них - эпибрассинолид(препаративная форма Эпин), разрешен для применения в сельском хозяйстве как средство повышения урожайности картофеля в полевых условиях путем опрыскивания вегетирующих растений в период бутонизации и цветения 6. Результаты проведенных исследований показывают, что при введении брассинолида,эпибрассинолида или гомобрассинолида в питательную среду у черенков значительно сокращается период роста стеблей и корней, значительно увеличивается выход растений,пригодных для черенкования, увеличивается число междоузлий, за счет чего коэффициент размножения увеличивается в 2-3 раза. Полученный семенной материал приобретает устойчивость к вирусной инфекции и дает увеличение урожая в последующих поколениях. Применение брассиностероидов позволяет отказаться от предварительного проращивания клубней при повышенной температуре (термотерапии), что сокращает общее время, необходимое для получения растений, готовых к черенкованию. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного применения брассиностероидов для микроклонального размножения оздоровленного семенного материала картофеля. Опыты проводили с растениями картофеля поздних и среднеспелых сортов с замедленным периодом роста в культуре, таких как Темп, Белорусский 3, Сантэ. Растения картофеля названных сортов, имеющие 5-8 листочков, извлекали пинцетом из пробирки и на чашке Петри скальпелем или лезвием бритвы разрезали на черенки,включающие часть стебля с одним листочком. Черенки высаживали в пробирки с питательной средой на глубину междоузлия и помещали в термокамеру. Работу проводили в стерильном боксе, инструменты и посуду стерилизовали перед черенкованием каждого растения. В качестве контроля использовали стандартную питательную среду Мурасиге-Скуга или эту же среду с незначительными изменениями по содержанию солей, состав которой приведен ниже Микросоли (мг/л) Макросоли (г/л) Н 3 ВО 3 6,20 43 16,50 22,30 3 19,00 44 Н 2 О 8,60 0,44 44 Н 2 СаС 22 Н 2 0,83 3,70 47 Н 2 0,025 КН 2 РО 4 1,70 45 Н 2 0,25 Трилон Б 0,25 42 Н 2 0,025 0,135 СоС 126 Н 2 2(4)39 Н 2 Витамины (мг/л) Регуляторы роста (мг/л) Никотиновая кислота 0,5 Аденин 0,25 Пиридиксин, мл 0,5 Индолилуксусная кислота 2,00 Тиамин 0,1 Гиббереллин 1,00 Среда содержала также сахарозу в количестве 10-30 г/л (углеводное питание) и агарагар (6-8 г/л). Пример 1. В модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга вместо гиббереллина был введен один из названных брассиностероидов -эпибрассинолид в количестве 0,02 0,20 0,25 0,30 0,40 0,50 мг/л, количество индолилуксусной кислоты было уменьшено до 1 мг/л. Табл. 1 содержит данные, полученные при замене гиббереллина на эпибрассинолид для сорта картофеля Темп. 3 5698 1 Таблица 1 Влияние брассиностероидов на рост и развитие растений картофеля сорта Темп при микроклональном размножении Эпибрассинолид Высота растений на 8- Общее колКол-во ин- Кол-во по- ой день после посадки во раст.,Общее колфицирогибших пригодных к во раст. ванн. раст. раст. 1 см 3 см 4 см 4 см черенкованию шт шт шт шт шт шт шт шт При введении брассиностероида в питательную среду у черенков начинается интенсивный рост стеблей и корней уже на третий день после посадки. Как видно из табл. 1, через 8 дней растения картофеля сорта Темп полностью отрастают и готовы к черенкованию(14 дней в контроле). Выход растений, пригодных к черенкованию, составляет 97,5 в сравнении с 72,5 в контроле, эффект по увеличению количества растений, пригодных к черенкованию, проявляется даже при минимальной концентрации эпибрассинолида в растворе (0,02 мг/л) и достигает максимума уже при концентрации 0,25 мг/л, так что дальнейшее повышение концентрации не имеет смысла. Это же было отмечено и для брассинолида и гомобрассинолида на всех сортах, что будет видно из нижеследущих таблиц. При этом было отмечено не только вытягивание стебля, как при использовании гиббереллина, но и увеличение числа междоузлий (7-9 штук против 3-4 в контроле), так как гиббереллин влияет только на деление клеток в меристематических зонах, а брассиностероид,кроме того, оказывает влияние на дифференцирование тканей. Увеличение числа междоузлий позволяет получить больше черенков с одного растения, т.е. повысить коэффициент размножения более чем в два раза. Определение у опытных растений вирусной инфекции(вирусы мозаичной группы, вирус скручивания листа) методом иммуноферментного анализа показало ее отсутствие. Пример 2. В модифицированную питательную среду Мурасиге-Скуга вместо гиббереллина был введен один из названных брассиностероидов - гомобрассинолид в количестве 0,02 0,20 0,25 0,30 0,40 0,50 мг/л, количество индолилуксусной кислоты было уменьшено до 1 мг/л. Табл. 2-4 содержат данные, полученные при замене гиббереллина на гомобрассинолид для сортов картофеля Темп, Белорусский 3 и Сантэ. Таблица 2 Влияние брассиностероидов на рост и развитие растений и корневой системы картофеля сорта Темп при микроклональном размножении Гомобрассино- Общее кол-во лид растений 5698 1 Таблица 3 Влияние брассиностероидов на рост и развитие растений и корневой системы картофеля сорта Белорусский 3 при микроклональном размножении Гомобрассино- Общее кол-во лид растений Кол-во корне- Кол-во растений, привых отростков годных к черенкованию шт шт Таблица 4 Влияние брассиностероидов на рост и развитие растений и корневой системы картофеля сорта Сантэ при микроклональном размножении Гомобрасси- Общее кол-во Кол-во инфи- Кол-во корне- Кол-во растений, принолид растений цир. растений вых отростков годных к черенкованию(мг/л) шт шт шт шт Контроль 40 5 25 18 45,0 0,02 40 0 40 37 92,0 0,20 40 0 38 39 99,0 0,25 40 0 40 37 92,0 Данные табл. 2-4 показывают, что аналогично эпибрассинолиду действует на развитие растений гомобрассинолид значительно стимулируется рост корневой системы, несмотря на уменьшение количества ИУК в питательной смеси инфицированные растения при использовании оптимальной концентрации отсутствуют. Кроме того, выход растений, готовых к черенкованию, составляет через 8 дней 92-100 в сравнении с контролем 75,0 для сорта Темп, 50,0 для сорта Белорусский 3 и 45,0 для сорта Сантэ. Аналогичные результаты по всем параметрам получены при использовании брассинолида. Пример 3. Растения, полученные из черенков, выращенных на питательной среде с добавлением одного из трех брассиностероидов, высаживали в теплице для получения первого клубневого поколения. Табл. 5 содержит данные об урожае первого клубневого поколения картофеля сорта Темп, выращенного в теплице из растений, полученных в культурес применением брассиностероидов в сравнении с растениями, выращенными на стандартной питательной среде. Таблица 5 Урожай первого клубневого поколения картофеля сорта Темп, выращенного в теплице из растений, полученных в культурес применением эпибрассинолида Эпибрассинолид Общее количество растений шт 40 40 40 40 Общее количество клубней штк контр. 170 100 166 97,6 200 117,6 309 181,7 5 5698 1 Данные табл. 5 на примере эпибрассинолида показывают, что стимулирующий эффект брассиностероидов сохраняется в первом клубневом поколении растений, выращенных из черенков, полученных на питательной среде с добавлением брассиностероидов. Увеличивается среднее число клубней на одно растение, и в результате увеличивается урожай ценного элитного семенного материала. При оптимальной концентрации это увеличение составляет более 80 . Пример 4. Клубни первого поколения, полученного из растений, выращенных на питательной среде с добавлением брассиностероидов, были высажены в поле. В табл. 6 приведены данные по урожайности второго клубневого поколения и пораженности растений вирусными заболеваниями. Таблица 6 Влияние брассиностероидов на поражаемость растений вирусами и урожайность картофеля сорта Темп в полевых условиях (второе клубневое поколение) Эпибрассинолид В том числе по вирусам,кол-во раст. в Данные табл. 6 свидетельствуют о значительном снижении вирусной инфекции у растений, полученных из клубней первого поколения, выращенных, в свою очередь, из черенков на питательной среде с добавлением брассиностероидов. Наблюдается также достоверное увеличение урожайности картофеля (до 56 ), выращенного в полевых условиях из семенного материала, полученного ранее в теплице из оздоровленных черенков. Таким образом, при введении одного из изученных брассиностероидов (брассинолид,24-эпибрассинолид или 28-гомобрассинолид) в питательную среду у черенков начинается интенсивный рост стеблей и корней уже на третий день после посадки. Через 8 дней растения полностью отрастают и готовы для черенкования (14 дней в контроле), т.е. период роста сокращается в 1,5-2 раза. Значительно увеличивается выход растений, пригодных для черенкования. Так на восьмой день он по всем сортам составлял 92-100,0 в сравнении с контролем 72-75,0 у сорта Темп, 50,0 и 45,0 у сортов Белорусский 3 и Сантэ,соответственно. Растения хорошо развиты, имеют интенсивную зеленую окраску. Добавление брассиностероидов положительно влияет не только на рост растений (удлинение стебля), но во всех случаях увеличивается число междоузлий (7-9 шт. в сравнении с 3-4 шт. в контроле), за счет чего коэффициент размножения увеличивается в 2-3 раза. Определение у опытных растений вирусной инфекции (вирусы мозаичной группы и вирус скручивания листа картофеля - ВСЛК) методом иммуноферментного анализа (ИФА) показало полное ее отсутствие при оптимальной концентрации брассиностероида в опытахв отличие от контроля. Полученный семенной материал приобретает устойчивость к вирусной инфекции и дает увеличение урожая в последующих поколениях. Применение брассиностероидов позволяет отказаться от предварительного проращивания клубней при повышенной температуре (термотерапии), что сокращает общее время, необходимое для получения растений, готовых к черенкованию. 5698 1 Источники информации 1. Пузанков О.П., Гришанович А.К., Ященко Н.П., Матюшенко Л.А., Бобрик А.О.,Коновалова Г.И., Адамова А.И., Богдановский А.Ф. Методические указания по оздоровлению и ускоренному размножению исходного семенного картофеля. - Минск Ураджай,1988. - С. 3. 2. Писарев Б.А., Трофимец Л.Н. Семеноводство картофеля. - М. Россельхозиздат. 1982. - С. 126-137. 3. Биотехнологические методы получения и оценки оздоровленного картофеля (Рекомендации). - М. В.О. Агропромиздат, 1988. 4. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М. Наука, 1964. 5. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск Навукатэхнка, 1993. - С. 288. 6. Средства защиты и регуляторы роста растений. Справочник. - Минск, 1995. - С. 75. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.