Полипептиды, обладающие активностью лёгочного поверхностно-активного вещества, и фармацевтическая композиция для лечения респираторного дистресс-синдрома у млекопитающих

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ПОЛИПЕПТИДЫ, ОБЛАДАЮЩИЕ АКТИВНОСТЬЮ ЛГОЧНОГО ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНОГО ВЕЩЕСТВА, И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНОГО ДИСТРЕСССИНДРОМА У МЛЕКОПИТАЮЩИХ(71) Заявитель Бик Гульден Ломберг Хемише Фабрик ГмбХ(73) Патентообладатель Бик Гульден Ломберг Хемише Фабрик ГмбХ(57) 1. Полипептиды, обладающие активностью легочного поверхностно-активного вещества, общей формулы где АН или ,или ,,или . 2. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что Аили ,, С . 3. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что,,. 4. Полипептид по п. 1, отличающийся тем, что АН, В, С. 5. Фармацевтическая композиция для лечения респираторного дистресс-синдрома (РДС) у млекопитающих, включающая действующее вещество в эффективном количестве, фосфолипиды и жирную кислоту, отличающаяся тем, что в качестве действующего вещества она содержит легочный поверхностно-активный полипептид по любому из пп. 1-4 и дополнительно содержит электролиты. 6. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит, по меньшей мере, один легочный поверхностно-активный полипептид из группы - и -. 7. Фармацевтическая композиция по п. 6, отличающаяся тем, что она содержит -. 8. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что в качестве фосфолипидов она содержит дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), пальмитоилолеилфосфатидилглицерин (ПОФГ) и/или фосфатидилглицерин (ФГ). 9. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что в качестве жирных кислот она содержит пальмитиновую кислоту. 4124 1 10. Фармацевтическая композиция по п. 5, отличающаяся тем, что в качестве электролитов она содержит соли кальция и/или натрия. Изобретение относится к легочным поверхностно-активным полипептидам, способу их получения и к содержащим их композициям. Легкие всех позвоночных животных содержат смесь веществ, называемую как легочное поверхностноактивное вещество. Она проявляет поверхностно-активные свойства и настолько понижает поверхностное натяжение в альвеолярной области легких, что предотвращается коллапс конечных участков дыхательных путей при выдохе. Эта смесь веществ регулирует поверхностное натяжение динамическим образом, так что ожидаемый, согласно закону Лапласа, коллапс мелких альвеол в пользу более крупных благодаря соответствующей адаптации поверхностного натяжения не происходит. В результате этого образуется хорошо сбалансированная, гистологически и физиологически стабильная структура легких. Легочное поверхностно-активное вещество выделяется альвеолярными пневмоцитами типав виде пластинчатых телец. Они представляют собой компактные образования из фосфолипидных двойных слоев с высоким содержанием дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ) и фосфатидилглицерина (ФГ). Другими основными компонентами, содержащимися в легочных поверхностно-активных веществах, являются протеины, которые обозначаются как -, - и -. - представляет собой высокомолекулярный гликопротеин, играющий основную роль в регуляции секреции. Протеины - и в меньшей степени - выполняют функцию термодинамических катализаторов при формировании мономолекулярной поверхностной пленки (в более узком смысле - поверхностно-активного вещества). Благодаря наличию этих протеинов кинетика расширения чрезвычайно ускоряется. Только вследствие этого без задержек возможна адаптация состава поверхностно-активного вещества к соответствующим требованиям поверхностного натяжения. Эти свойства отражаются в крайне гидрофобном характере протеинов, в частности -. Путем экстракции легочной ткани или промывки легких животных можно получить препараты поверхностно-активного вещества, которые как в физико-химической измерительной аппаратуре, например на животных моделях, так и при клиническом применении проявляют способность компенсировать недостаток поверхностно-активного вещества и тем самым пригодны, например, для терапии детского синдрома удушья(респираторный дистресс-синдром новорожденных (РДСН. Однако этим препаратам, полученным из животных, присущи серьезные недостатки. Состав фосфолипидов сильно зависит от вида животного, его здоровья и состояния питания и может быть лишь в ограниченной степени сбалансирован примешиванием определенных компонентов. Содержание поверхностно-активных протеинов, а также соотношение -/- подвержено тем же неопределенностям. Кроме того, в терапевтически применяемой смеси также содержатся возможные продукты протеолитического разложения протеинов или модифицированные производные (например, в результате окисления метионина). При продолжительном применении или аппликации больших количеств поверхностно-активного вещества, что может быть необходимо, например, при синдроме удушья у взрослых (шоковые легкие,респираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ или в других случаях применения, например при использовании поверхностно-активного вещества в качестве буксира для других веществ при легочной аппликации, вопрос, связанный с пополнением вещества, остается открытым. Поэтому эти проблемы предлагается решать путем получения протеинов методами генной инженерии. Так как рекомбинантные протеины, в частности при применении бактериальных систем экспрессии, могут быть получены практически в неограниченных количествах и существует возможность применения современных методов анализа и контроля качества, то, используя синтетические фосфолипиды, можно получить поверхностно-активное вещество точно определенного состава. Это вещество может оптимально удовлетворять терапевтическим требованиям. Центральная часть человеческого протеина - (см. формулу , где А - Н илиВ -С - ), который особенно важен для кинетики расширения, состоит исключительно из алифатических, очень гидрофобных аминокислот, таких как валин, лейцин и изолейцин. Длина этой центральной части (аминокислоты 12-34) позволяет интегрировать пептид в мономолекулярную фосфолипидную пленку. В последовательности (позиция 3-6) оба -остатка тиоэтерифицированы пальмитиновой кислотой по 2 4124 1 группам. Пальмитиновая кислота дополнительно повышает гидрофобный характер всего протеина и одновременно закрывает обе -группы цистеинов и защищает их от окисления и образования дисульфидного мостика. Центральная область (аминокислоты 13-34) образует трансмембранную пространственную спираль. Эта область примыкает к -концу с помощью полярной последовательности, содержащей положительно заряженные аминокислоты (, 10 , 11). В международной заявке 91/18015 описывается получение рекомбинантного -С и мутантов -. В этой заявке, помимо прочего, предлагается заменить оба цистеина в положениях 4 и 5 двумя серинами. Преимущество этого при получении состоит в том, что после выделения очень гидрофобного протеина отпадает необходимость в технически трудоемком пальмитоилировании обоих цистеинов. Неожиданно было обнаружено, что -С-мутанты, отличающиеся от человеческого белка - заменой обоих цистеинов в положениях 4 и 5 фенилаланином или триптофаном и заменой метионина в положении 32 изолейцином, лейцином или серином, не обладают никакими функциональными потерями в сравнении с природным -, а в отношении стабильности даже превосходят его. При этом значительно упрощается получение с использованием методов генной инженерии с достижением более высокого выхода. Новые полипептиды с легочной поверхностной активностью могут быть получены с высокой чистотой. Предметом изобретения являются поэтому полипептиды с легочной поверхностной активностью, имеющие аминокислотную последовательность общей формулы,где А - Н илиВ -илии С - ,или . Предпочтительным предметом изобретения являются полипептиды обшей формулы , где А обозначает Н или , В обозначаети С обозначает , при этом наиболее предпочтительно А обозначает Н, В обозначаети С обозначает . Еще одним предметом изобретения являются фармацевтические композиции, которые отличаются тем,что содержат один или несколько полипептидов по изобретению и при необходимости дополнительно содержат один или несколько легочных поверхностно-активных полипептидов из группы - и -, предпочтительно -. Полипептиды по изобретению могут быть получены либо по известным методам твердофазного пептидного синтеза, либо с помощью соответствующих рекомбинантных векторов в клетках-хозяевах. Методы конструирования векторов, методы трансформирования клеток, методы, вызывающие экспрессию протеина в трансформированных клетках, и методы выделения и очистки экспрессированных протеинов известны специалистам в данной области техники ( 86/03408,87/06588 и 91/18015). При получении векторов для экспрессии - в бактериальных системах используют обычные методы рекомбинантной ДНК. Экспрессия гидрофобного -С-протеина в бактериях возможна в большом количестве и без ущерба для клетки-хозяева только в форме пригодных слитых протеинов, как, например, совместно с хлорамфениколацетилтрансферазой . Например, вектор 152 кодирует -терминальную областьи предназначен для клонирования внутри рамки считывания (5-)- и (3-)Р-фрагментов ДНК, кодирующих -.и - связываются при этом на белковом уровне друг с другом через чувствительное к гидроксиламину место слияния (С). Такие векторы, как 152, позволяют осуществлять контролируемую экспрессию соответствующих слитых протеинов вплоть до производственного масштаба (ферментация). Экспрессия слитых белков вызывает образование телец включения в клетке-хозяине. При этом длина доли САТ в слитом протеине может быть изменена таким образом, что будут достигнуты высокие выходы телец включения при высокой доли -. Помимо бактерий экспрессия может происходить и в большом количестве систем-хозяевах, например в клетках млекопитающих, дрожжей и насекомых. Пригодные для различных клеток-хозяев конструкции ДНК синтезируют по известным методам и встраивают обычным образом с соответствующими управляющими последовательностями в геном клеток-хозяев. На синтезаторе ДНК /обычным фосфоамидитным методом могут быть синтезированы два олигонуклеотида ДНК. Первый олигонуклеотид ДНК образует кодирующую (нетранскрибируемую) нить ДНК длиной 118 нуклеотидов. Эта нить кодирует (в направлении 53) специфический в отношении 5-конец для последующего субклонирования, место расщепления / гидроксиламином и человеческий -, начиная с 4124 1 формуле . При этом известная аминокислотная последовательность человеческого -С-протеина по правилам генетического кода переводится в ДНК. Однако последовательность модифицируется таким образом,что оба цистеина в положениях 28 и 29 -С-последовательности-предшественника заменяются фенилаланином или триптофаном, а метионин в положении 56 последовательности-предшественника заменяется изолейцином, лейцином или серином. Таким же образом дополнительно могут быть учтены частоты использования кодона клетки-хозяина. Измененная -С-последовательность, содержащая в положениях 4 и 5 фенилаланин и в положении 32 изолейцин (нумерация согласно формуле (, обозначается в соответствии с обычным однобуквенным кодом для этих обеих аминокислот как 34(/). Далее смысловая нить ДНК содержит терминирующий ТАА-кодон для прерывания рибосомной трансляции, а также специфический в отношении 3-конец. Второй олигонуклеотид ДНК представляет собой комплементарную, некодирующую (антисмысловую) нить, состоящую из 110 нуклеотидов. Синтетически полученный -С-фрагмент ДНК клонируют в пригодный вектор экспрессии, как, например, 152. Этот вектор составлен из рКК 233 (фирма ), содержащего ген устойчивости к ампициллину и являющегося производным 322. -промотор может быть заменен на -промотор,как в 152. Могут быть использованы также и другие индуцируемые промоторы. Для субклонирования -С-фрагмента комплементарные олигонуклеотиды ДНК сначала гибридизируют друг с другом. Получающаяся в результате двойная нить ДНК имеет выступающие однонитевые концы(/). Встраивание в векторную ДНК осуществляется обычным путем после расщепления векторной ДНК с помощью /, очистки требуемых фрагментов векторной ДНК посредством электрофореза в агарозном геле и гибридизации -С-ДНК и векторных фрагментов по сцепленным концам. Затем оба фрагмента по известным методам связывают друг с другом путем лигирования. Для амплификации ДНК и выделения плазмид производят трансформацию по обычным протоколам, например, в кальций-хлорид-компетентные клетки ММ 294 . и для селекции несущих плазмиду клеток покрывают на -агаровых пластинках ампициллином. Из полученных устойчивых к ампициллину (резистентных) колоний выделяют плазмидную ДНК и анализируют ее с помощью соответствующих комбинаций рестрикционного фермента. Выбирают клоны с ожидаемой рестрикционной картой ДНК. Путем полного секвенирования плазмидной последовательности подтверждается правильно осуществленная инсерция последовательности 34(/). Полученные таким образом плазмидные векторы позволяют осуществлять экспрессию слитого протеинапод контролем -промотора (или других промоторов). Рекомбинантный слитой протеин выпадает в клетках-хозяевах после индукции в форме телец включения. Слитой протеин 15234(/) имеет следующую представленную обычным однобуквенным кодом аминокислотную последовательность 34 аминокислоты -(/) в положениях 153-186 слитого протеина выделены подчеркиванием и указанием положений 1-34. Последующее расщепление гидроксиламином для разделенияи - происходит между -152 и-153 (соответствует 1-й аминокислоте в -С-пептиде). Выделение и очистка -С-пептида осуществляется по обычным в химии белка методам. Полипептиды по изобретению можно применять отдельно или в комбинации в фармацевтических композициях, которые удовлетворяют требованиям лечения дыхательных путей. Эти композиции пригодны не только для лечения синдрома удушья у недоношенных новорожденных и у взрослых, но также и для лечения пневмонии и бронхита. Кроме того, полипептиды по изобретению пригодны в качестве буксира для лекарственных веществ, вводимых путем ингаляции. Наряду с полипептидами композиции содержат фосфолипиды, предпочтительно такие фосфолипиды, которые содержатся в природных составах, обладающих легочной поверхностной активностью, как, например,предпочтительно дипальмитоилфосфатидилхолин (ДПФХ), пальмитоилолеилфосфатидилглицерин (ФОФГ) и/или фосфатидилглицерин (ФГ). Для достижения оптимальной вязкости композиции содержат ионы кальция или магния, а также хлорид натрия. Для определения вида и количества отдельных компонентов композиций специалист может ориентироваться, во-первых, на известный состав природного легочного поверхно 4 4124 1 стно-активного вещества, а во-вторых, на многочисленные предложения, известные из уровня техники, например из европейских патентных заявок ЕР-А 0119056 и ЕР-А 0406732. Предпочтительные композиции по изобретению содержат 80-95 мас.фосфолипидов, 0,5-3,0 мас.полипептидов, 4-7 мас.жирной кислоты, предпочтительно пальмитиновой кислоты, и 1-3 мас.хлорида кальция. Пример получения. 1. Штамм-продуцент. Применяемый штамм-продуцент . 199 имеет происхождение из штамма ММ 294 . К 12, который депонирован под 5208 в Германской коллекции микроорганизмов и клеточных культур ГмбХ (,Брауншвейг). Вектор экспрессии 15234(/), содержащий ген слитого протеина 15234(/), был получен из ДНК-последовательности 322, т.е. -производного .(ред.), (1988),,, . В плазмиде 233-2, поставляемой фирмой , с помощью / был вырезан -промотор и заменен синтетическим -промотором (р 233). Последний состоит из промоторной области (участок связывания РНК-полимеразы), операторной области (участок связывания -репрессора), последовательности ШайнаДальгарно (/-последовательности), а также сайтов рестрикции для клонирования. За -промотором был вставлен ген (152), кодирующий 152 аминокислоты 5-части бактериальной хлорамфеникол-ацетилтрансферазы. С частью 152 ДНК-последовательности был слит синтетический фрагмент гена, кодирующий 34 аминокислоты подобного человеческому протеина -(/). Функциональный транскриптон(/) заканчивается бактериальной -последовательностью Т 1 Т 2, терминирующей транскрипцию. Полученная конструкция обозначается как 15234(/). Вектор (/) имеет следующие функциональные элементы ген 15234(/), управляемый -промотором и Т 1 Т 2- терминатором транскрипции-область и соседние области, которые управляют чистом копий плазмиды ген . После помещения плазмиды в клетку-хозяина последняя имеет высокое число копий гена(/), контролируемого -промотором. -репрессор вырабатывает сама клетка-хозяин. Ферментативное получениерегулируется концентрацией триптофана в среде, соответственно добавлением -АА(-индолилакриловой кислоты). 2. Периодическая ферментация. С помощью пробирки(культура глицерина) культуральную среду (состав см. ниже) высевают в шейкер (предварительная или начальная культура 1 л) и при 37 С инкубируют при встряхивании и при сильной ампициллинзависимой селекции. За ростом следят по оптической плотности при 578 нм. По достижении начальной культурой . 199 оптической плотности более 3 культуру высевают в 10 литровый ферментер и продолжают выращивание бактерий при уменьшенной ампициллинзависимой селекции. После достижения значения оптической плотности между 5 и 6 10-литровую культуру переносят в 100 литровый ферментер и продолжают инкубировать в тех же условиях. После достаточного роста путем добавления, например, 40 мг/л -АА индуцируют управляемый -промотором транскриптон(/). После индукции для сбора клеток ферментацию продолжают дополнительно в течение 4-5 ч. Во время ферментации напрямую контролируют и регулируют парциальное давление кислорода (рО 2),значение рН и температуру бульона в ферментере. Значение рН поддерживают постоянным с помощью раствора едкого натра, парциальное давление кислорода (рО 2) регулируют путем введения кислорода и с помощью числа оборотов мешалки. Оптическую плотность при 578 нм и концентрацию источника С в среде определяют через определенные интервалы. Пенообразование контролируют с помощью пенного датчика, с помощью которого при необходимости определенными дозами добавляют антивспениватель для подавления пенообразования. В различные моменты времени отбирают аликвоты культурального бульона. После лизиса бактерий протеины . для контроля экспрессии разделяют на полиакриламидном геле и подкрашивают. Процентную долю (доминантных) протеинов во всем протеине . определяют с помощью денситометра. Вскоре после индукции рекомбинантного гена появляется новая доминантная протеиновая полоса . Культуральная среда имеет следующий состав. Соевый пептон 27,0 г/л, дрожжевой аутолизат 14 г/л,5,0 г/л, К 2 НРО 43 Н 2 О 6,0 г/л, КН 2 РО 4 3,0 г/л,472 О 0,5 г/л, глицерин (99,5 -ный) 30,0 г/л, антивспениватель 673 (фирма.) 0,2 мл/л,-триптофан 80,0 мг/л и ампициллин 20 мг/л для 1-й предварительной культуры и 5 мг/л для 2-й предварительной культуры и 100-литрового ферментера. Перед нагреванием в автоклаве и стерилизацией комплексной питательной среды рН с помощью 2 Нустанавливают на 6,8. Для предварительной культуры в 10-литровом ферментере скорость мешалки 5 4124 1 составляет 750 об/мин, а расход кислорода составляет 10 л/мин при 37 С, для главной культуры в 100 литровом ферментере скорость мешалки составляет 400 об/мин, а расход кислорода составляет 70 л/мин при 37 С. Антивспениватель при необходимости добавляют одноразовым шприцем через перегородку. Приблизительно через 4 ч после индукции клетки отделяют от культурального бульона фильтрацией и/или центрифугированием. Влажную клеточную массу собирают в емкости из нержавеющей стали и в течение ночи перемешивают с 10 л переваривающего буфера (рН 8,0) в холодильнике (16 часов, 4 С). Перемешанную клеточную суспензию обрабатывают (при комнатной температуре) в гомогенизаторе высокого давления (700 бар) и снова собирают в стерильную емкость из нержавеющей стали. Затем сразу же путем фильтрации и/или центрифугирования (центрифуга 2-, 27000) при 4 С собирают тельца включения, ресуспендируют в буфере (около 1 л) и порциями, например приблизительно по 350 мл, переносят в 1-литровую круглодонную колбу и лиофилизуют в течение 96 ч. Из 100-литровой ферментационной загрузки получают приблизительно 200 г сухих телец включения с содержанием слитых протеинов более 20 мас. . Лиофилизованные тельца включения могут храниться при -20 С месяцами. 3. Расщепление слитого протеина и очистка липофильного пептида -(/). 100 г Сухих телец включения растворяют при легком нагревании в 1,6 л 8-молярного раствора гидрохлорида гуанидина (917,1 г). Нерастворившийся остаток отфильтровывают через складчатый фильтр. Для расщепления слитого протеина по месту связывания - к раствору добавляют 167 г гидроксиаммонийхлорида и рН раствора доводят 2 Ндо 9,6. Расщепляющий раствор затем оставляют стоять на 3-4 дня при комнатной температуре при перемешивании. По завершении реакции добавлением 6,4 л трис-буфера (рН 8,0) осаждают -(/) и его отделяют с помощью центрифугирования (центрифуга 2-В,20000). Надосадочную жидкость декантируют, осажденные центрифугированием - повторно суспендируют в 400-500 мл трис-буфера и снова центрифугируют при тех же условиях в течение 30 мин. Осажденный центрифугированием - растворяют в 3,5 л смеси хлороформа, метанола и соляной кислоты (1,75 л СНС 31,75 л СН 3 ОНприблизительно 30 мл 2 Н НС). Этот сырой раствор - далее очищают с помощью препаративной жидкостной хроматографии высокого давления (ЖХВД) на С 8 в качестве материала обращенной фазы. Хлороформ/метанольный экстракт перед загрузкой на колонку для препаративной ЖХВД разбавляют 90 -ным метанолом в соотношении приблизительно 12. Из этого раствора в колонку (диаметр 5 см) можно загружать, например, приблизительно 400 мг -(/) (например, разбавленного 2 л сырого экстракта). -(/) элюируют в кислых условиях (рН 2-3) с использованием градиента вода/изопропанол (см. таблицу). Приблизительно через 30 мин хроматографирования в той области, в которой элюирован - (УФ-обнаружение при 220 нм), собирают 4-6 фракций по 200 мл. Фракции проверяют с помощью аналитической ЖХВД и соответственно направляют в банк данных. Если пробы необходимо хранить, то их замораживают в жидком азоте и хранят в морозильной камере при -80 С. Чистота получаемого-(/) составляет 98,5-99,5 . Условия разделения представлены в таблице. 4. Встраивание -(/) в фосфолипидную матрицу. Липофильный пептид -(/) смешивают в изопропанольном растворе с компонентами фосфолипидной матрицы и осаждают путем впрыскивания в разбавленный раствор поваренной соли (0,065 вес/вес) при комнатной температуре в гомогенной смеси с компонентами фосфолипидной матрицы. Из суспензии легочного поверхностно-активного вещества на стаканчиковой центрифуге отделяют легочное поверхностно-активное вещество (ЛПАВ), ресуспендируют в растворе электролита (, 2) и с помощью 0,1 НрН доводят до 6,5. Эту водную суспензию разливают по 20-миллилитровым ампулам и лиофилизуют. Приведенные в нижеследующем примере получения весовые и объемные данные относятся к получению 10 граммового препарата легочного поверхностно-активного вещества. 7,00 г Дипальмитоилфосфатидилхолина (ДРФХ), 3,08 г аммониевой соли пальмитоилолеилфосфатидилглицерина (ПОФГ х 4) и 0,25 г пальмитиновой кислоты растворяют при 40 С в 200 мл 90 ного изопропанола и затем охлаждают до комнатной температуры. Полученный раствор фосфолипида объединяют с 1 л раствора, полученного после ЖХВД-очистки и содержащего 200 мг очищенного -(/). Значение рН полученного распыляемого раствора доводят при перемешивании раствором бикарбоната(приблизительно 5 мл 5 -ного раствора 3) до 4,5. Распыляемый раствор при интенсивном перемешивании вводят при комнатной температуре со скоростью впрыскивания 25 мл/мин через однокомпонентное сопло в 9,6 л разбавленного раствора(0,065 вес/вес). Образуется опалесцирующий раствор, из которого после двухчасовой выдержки при 4-8 С при впрыскивании раствора электролита (3,0 г 222 и 61,3 гв 300 мл 2) в осадок выпадает препарат легочного поверхностно-активного вещества. Суспензию легочного поверхностно-активного вещества(общий объем 10,8-11,0 л) выдерживают в течение ночи при 4 С, а затем в течение 30 мин центрифугируют на стаканчиковой центрифуге(2-) при 16000. Для удаления остатков изопропанола образовавшуюся при центрифугировании лепешку ресуспендируют в половинном объеме 0,65 -ного раствора поваренной соли и повторно центрифугируют. Эту стадию повторяют 3-4 раза. Лепешку, полученную на заклю 6 4124 1 чительной стадии центрифугирования, растворяют в 400 мл 0,65 -ного раствора , значение рН с помощью 0,1 Ндоводят до 6,5 и распределяют порциями по 6,2 г в 20-миллилитровые ампулы. Содержимое ампул лиофилизуют следующим образом замораживают на 6 ч при -45 С и нормальном давлении,сушат вымораживанием в течение 54 ч при 0,16 мбар и -20 С, а затем для дальнейшей интенсивной сушки еще в течение 5 ч при -20 С и 0,02 мбар. Таким путем получают 65-66 ампул, содержащих по 0,150 г легочного поверхностно-активного вещества(рассчитано без ). Сухие пробы легочного поверхностно-активного вещества хранят в холодильной камере при 4 С, а перед применением их необходимо ресуспендировать водой или физиологическим раствором(суспензионная концентрация 25 мг/мл). В каждой ампуле содержится 95,6 мг дипальмитоилфосфатидилхолина, 42,1 мг пальмитоилолеилфосфатидилглицерина (аммониевая соль), 2,7 мг -(/), 6,8 мг пальмитиновой кислоты, 2,9 мг хлорида кальция (безводного). Условия разделения КолонкаС 8 100 А 16 мкм 300 мм, внутренний диаметр 50 мм Элюент А Вода для ЖХФД из установкиБ изо-РОН с линейным градиентом В 60 ммоль/л НС (разбавление из дымящей соляной кислоты) Градиент Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 7