Способ получения клона бактерий Escherichia coli, трансформированного плазмидой pBR 322, содержащей вставку Pst-1, кодирующую интерферон ( или (

Целью изобретения является одноч временный отбор кленов, несущих рекомбинатне молекулы ДНК с геном,кодирУЮЩРШМ г И/Ъ чаитерферон, Одновременный отбор.клонов обестпечивается наливном гомологии между(от 5 до 7) функциональным 1 На и 1 РЫргенами. При этом участок гомологии имеет длину 1 Знуклеотидов со следующей формулой.5 ССТТСТ 0 БААСТ 03. Кроме того, и РНК из клеток Папаша вьщеляютрчереэ 9 ч послеиндукции вирусом, синтез к ДНК осу ществляют на (АЗРНК с величиной мотЛЭКУЛЫ 6 и 18 8, а днДНК получают размером 600 п.о.П р и м е р 1. Выбирают подходят щие клетки для производства поли(А) РНК, которые содержат человеческие 1 РШмъг 1 ГЫ-р- иРНК.Различные человеческие клетки индуцируют сендайвирусом, для про изводства интерферона известными ме тодамм. Через 24-48 ч определяют содержание ТРШ-Ыи ШГП-р нейтралиэацит ей специфической для типов антисывот роткой. 7 Выявляют, что клетки намальваТест на нейтрализацию проводят следующим образом.Приблизительно 10 ед. интерферона инкубируют при 37 С в течение 60 80 мин1) антисыворотка против 1 РЫы окончательное раэбавлене 11002) антисыворотка против человечесе кого ШРИ-р конечное разбавление 1 З 00Клетки отделяют центрифугированиемв течение 20 мин при 1000 5, один раз промывают буфером ПР-дО (0,1 дмоль ЫаС 1, 1,5 ммоль М 5 С 1 д, 10 ммоль трисо НС 1, рН 7 д) и ресуспендируют в ПР 40 (5 Ье 11)-буфере с 0,52 ненонного детергента ШР-40 (Шелп) и 2 мг/моль бентонита. Через 5 мин Б ледяной бане клеточное ядро цеитрифугируют,пеллетнруют, как описано вьше, экстт рагируют содержащую РНК цитоплазмчес кую фракци добавлением 2 натрнйт додецилсулъфата, 5 ммоль этиленднт нитрилотетрауксусной кислоты и 50 моль трисНС 1, рН 9, затем трижды смесвю фенол хлороформ и один раз хлороформом И непосредственно после этого осаждают РНК спиртом. Поли(А)РНК очищают с помощью олиготрезультате центрифугирования в 5 20 номградиенте сахарозы в 10 ммолъ буфера ацетата натрия, рН 55,.с ротором Бр 1 псо БЫ 27) разделяют по,величине молекулы И собирают молекулы величиной порядка 6 Б (единица седиментации) и 18 Б (для простоты названная полн 125-РНК). Содержание интерферонспецифичесляют в результате микроинъекции 125-РНК в ооциты херононуса,измеря ют активность интерферона в ооцитах. При этом получают 1 д 1 Г инъецированной(128-РНК среднего титра интерфет рона около 1000 ЕЕ ннтернациональт ная единица интерферона , считая на стандарт интерферона 69/19.При этом около ЗОК активности нейтралэуется антисывороткой против фтиа интерферона, в то время как общая активность нейтрализуется толь3) смесь первой ВТРй антисывог 45 ко смесью, состоящей из антиЫНиПосле инкубации определяют оста точную активность интерферона методом определения стерильныш пятен.П р и м е р 2. Получают поли(А) РНК, которая содержит человеческие 1 ГПф- иРНК из клеток намальва,индуцированных сендаивирусом.Разводят клетки намальва и инду цируют сендаивирусом. иЕНК выделяют через 9 ч после индукции сендаивиру сом, так как после этого интервала количество интерферонспецифическиш мРНКдостнгает максимума.П р И м е р З. Поли(А)РНК, которая имеет величину молекулы бт 8 8(125-РНК), применяют в качестве мат рицы для получения однониточной кдк,причем 40 рт/мл поли(А)РНК инкубит руют в 50 ммолъ трисНС 1, рН 8,3, 10 моль МБС 12, 100 молв КС 1, 1 ммоль ПТРБ, 0,4 ммолъ дитиотрейтола, 4 моль пирофосфата натрия, 20 г/мл олиго(деокси)тимидина 12-18 (Р 1 гбиохимя), 25 р 4 г/мл актииомицина В со 100 ед/мл АМ обратной транскриптатвы в течение 45 мин при д 4 т 45 С. Не С помощью этого метода регенериру посредственно после этого РНК гибри ется место расщепления рестрикцион-да РНКДНК-удаляют путем одночасо оной эндонуклеазой Рев 1 и в последвой инкубации в 0,3 моль ыаон при 5 ствии это можно использовать для то 50 С, после чего однониточную кДНКу го, чтобы вырезать из векторного гиб нейтрализуют и осаждают этанолом. д рида кднктвставку. А Вторая нитка ДНК, комплементарная Получение этим методом гибридк однониточной ДНК, синтезируется плазммды из рВВ 322 и намальваткднк при следующих условиях 30 иг/мл од 10 применяют для трансформации ЕзсЬег 1 нониточной кднк инкубируют в сита со 11 НВ 101.Этим методом полут 0,12 моль буфера фосфата калия, рН чают 30000 кланов трансформрованных 6,9, 10 ммоль М 5 С 1 10 ммоль дитиот клеток Е. со 11, которые разделяют на трейтола, 1 ммоль аЫтгз 30 о ед/мл микротитропластинах. ДНК полиерагы 1 (Во 1 Ьг 1 п 5 ег Мепп 15 П р и м е р 3. Трндекануклеотид ие 1 п) 6 ч 15 С. Затем экстрагируют метят в 50 ммопь тристНС 1, рН 7,5,фенолом и осаждают этанолом. 10 моль МеС 1 д, 5 ммоль дитиотрейто Полученную таким образом двуниточ- па, 0,1 ммоль спорт-гадина, 11 м 32 Рную смесь кДК уобоих концов нитки даденозинтрифосфата с 60 ед,/мл Тд модифицируют, удаляют выступающие 20 полинуклеотидкинаэы (вевпезаа Везет концы отдельных нитей. Для этого ДНК цагсп ЬаЪотатог 1 ев) в течение ннкубируют в 0,3 моль ШаС 1, 30 ммоль 30 мин при 37 С до специфической ацетата натрия, рн 4,5, 1 моль активности около 500 Ка/мольу 2 пС 1, с 1250 ед/мл 8 1 нуклеазы 5 конца молекулы.(М 1 ев ЪаЪогаЪог 1 ез)в течение 25 Этот меченый тридекануклеотид 30 мин при 37 С после чего экстраги 1 применяют в качестве праймера (Вайруют фенолом и осаждают этанолом. шее) для синтеза однониточной КДНК,Полученную таким образом двуниточную при этом в качестве матрицы служит кДНК разделяют на 520 ном градиен полн(А)ЛЩК из индуцироваиныхсендаи те сахарозы.в 10 ммоль буфера ацетата 30 вирусом клеток намальва. Реакцию пронатрия при рн 5,5, в 1 моль этиленч. водят при 510 кратном малярном издинитрилотетрауксусной кислоты и вы бытке праймера по отношени к РНК в деляют те фракци которые имеют по 50 ммопь трисНС 1,рН 8,3, 60-ммоль крайней мере 600 о.п. кДНК (0,5 диг) КС 1, 5 ммоль дитиотрейтола ЗОР г/млудлиняют приблизительно на 15 нуклео актиномцина 1, 4 ммольМ 5 С 1. 2 3 ГВДОВ ПУТЕМ ННЛОЖЕНИЯ ОЛИГОДЕЗОКСЦ 35цнтидна у 3 конца,обеихв резуль ЫтР 5 со 100 ед./мл АМУ обратной тете инкубаци в 140 ммоль калийкако -транскриптазы в течение 90 мин при энлата, рН 6,9, 30 моль трис-НС 1, З 7 С. После удаления РНК гибрид РНК рН 6,9, 2 моль СОС 11, 0,1 моль дит ДНК инкубируют 1 ч в 0,3 моль Ыз 0 Нтиотрейтола, 0,1 мг/мл ВБА, 5 имоль 40 при 5 ОС с последующей нейтрализациастгв с помощью 500 ед. термналъной ей 0,3 моль уксусной кислоты и кднк.трансферазы в течение 4 мин при 37 С. применяют в качестве пробы гибриднАливоту 2 Рдг рВВ 322 линеаризуют с е зации. Полученная таким образом помощью рестрикционной эндокуклеазы кДНК несет радиоактивную метку лишь РБ 1 СМЕСЬ Кдк УДЛНЯЮТ ПУТеМ.На 45 в молекулах, которые были синтезнрот ложення опигодезОксНгУаНидИН 8 У К 0 Н ттваны из интерферонспецифнческого три Ц 8 3 молекулы И М 0 дНФИдиРУЮТ ПОЛУ . деканукпеотида в качестве праймера Чая ВЫСТУПВЮЩИЕ КОНЦЫ ОПИГОДЕЗОКСН и, следовательно, обладает высокой гуаннднна. получают стабильные днднк специфичностью для опознания интерпутем основного спаривания концов 50 феронднктпоследовательности в гибри 1 опнгодеоксигуанидина со свободными дизации концами олигодезоксицитидина молекулы кдк. Для этого оба компонента этой П Р Н М е Р 4- КЛЗТКИ ОТДЕЛЬНЫХ реакции инкубируют в 0,1 ммоль ЫаС 1, с КЛОННРОЕЗННЫ трансфогмантов перед 1 моль этипендинитрилотетрауксусной 55 3 ддТ На НиТРЦеЛдП 3 НЫЙ ФИЛЬТР кислоты, 20 ммоль трисНС 1, рН 8, в (225 СМ величина ПОР 045 ръь течение 10 мин при б 5 С, затем в те М 1111 р 0 г Одев БСЬ 111 сНе 5) ВЫРЗШН чение 2,5 ч при д 5 С и затем в течет Ватт до реличины колонии 2 мм дннив ночи при 37 С. аметром Н ПОДГОТЗВЙНВЖТ Е гибриды 1 Г 12 Е 52 Е 1. КпоныР 1 Аб и-Р 2 В 10 анаг пизируют таким жеметодом.нации. Гибридизацию нуклеиновой ки слоты меченой на концах кДНК прово дят в смеси, содержащей 50 форме . амида, 4 к 5 Ет 1 к 5 Ет 0,15 моль ЫаС 1 5 ммоль зтилендинитрилотетрауксусной кислоты, 50 ммолъ трисНС 1, рн 8), 1 ъраствора Денхардта (о,о 2 к ВЗА,0,022 фиколла, 0,02 поливинилпиррои затем опрыскивают раствором 1 хББС. Фильтры высушивают при 2025 С икой пленкой (кодак ХЕ). Всего в реч зультате скрининга получают приблизит тельно 13000 трансформированны котклонов клонбанка содержат специфическую последовательность ассттст БОААСТО.Гибридизацию проводят, добавляя враствор гибридизации 50 рг/мл поли(П) и юрт/мл полн (Е) полиЮ), у фильтр промывают после гибридизациив 502 ном формамиде и 1 к Б 8 С 0 каэа лось, что клон Р 1 Н 1 гибридизируетболее чем 902 всех тридекаиуклеотидт позитивны клоиовпластины Р 1 и Р 2, а также некоторые клены пластины Е 52.тИдентичность многих этих клонированщ 5гибридизируется не только сам.с собой, а также с клоном позиции 1 С 12, П р и м е р 6. Поли(А)РНК отделя ЮТ ОТ ИНДУЦНРОВЗНЕЕЬПС. Ц НЗИНДУЕДНРОВЗН НЫХ КЛЕТОК д-хамальва, ДЕНЗТУРИРУЮТ В1,42 ном плавающем агаре, переносят она нитропеллюлозный фильтр н.гибри дизируют с плавммдной дНК,Рмечен ной с помощью никтрансляции. Плазмиды ную ДНК, которая произошла от инду цированного гена, гибридизируют в этой серии опытов только РНК из ннду цированных клеток, но не РНК из неиндуцированных клеток. Применяемые.для гибридизации плазмидыДНК явля ются г 1 н 1 (А), г 1 г 12 (в 1) Р 2 н 1 о(с) Р 1 А 6 (Е), Р 2 В 10 (Г). Из исптанныи плазмид гибридизировались только Р 1 Г 12, Р 2 Н 1 О и Р 1 А 6 только с РНК из индуцированных клеток, в то время как Р 1 Н 1 и Р 2 В 10 гибридизуются также с РНК из неиндуцированных клеток. Ве . личина молекулы РНК, гибридиаирующей си с Р 1 Р 12 и Р 2 Н 10, 11-12 З, велио12-14 8 (эти величины молекул известны для ТРПы или 1 ПриРНК.Плазминовить их содержание в интерферонднкн последовательности.и инкубируют при условиях гибридизации с поли(А)РНК из индуцированных.клеток иамальва. Получают связанную 1. Днкопоследовательность интерферона. Негибридизированную РНК смывают, гибридизированную РНК выплавляют из ДНКи инъецируют в ооциты Хепорцз 1 аеу 1 а..Если в ооцитах синтезируется интер феронпротеин антивирусные свойства которого могут быть доказан методом подсчета стерильных бляшек, 10 рп линеаризованной плазммдной ДНК денатурируют в 200 фи 0,5 н. Неон, ней тралиэуют 2 О 0 рАл 0,5 и. уксусной кислоты и 20 хБЕТ и фильтруют связыша нием на нитроцелпюлозном фильтре диаметром 2,5 мм. Фильтр высушивают,при комнатной температуре, выдержи,вают 2 ч при 8 ОСи затем в течение . 1 ч при 5 З 0 или также при 37 дС в смеси, содержащей 50 формамида, 20 моль пиперазинК,Ы-бис(2 зтан сульфокислоты) рН 6,5, 0,4 моль ПаС 1, 5 ммоль этилендинитрилотетра уксусной кислоты, 102 декстрансульфа та, 1 натрийдодецилсульфата,20 дг/мл Е. со 11 ЦЪРНК, 50 рт/мл поли(А)пре гибридиэированной, и в самомбуфере гпосле добавления 14 т 40 мг индуциро ванной намалъваНполи(А 7 РНК гибриди 7 1346048 В.в снесло содержащей 0,24 - ЗЕТ, 0,273 вставки клонов Р 1 г 12 и Р 2 Н 1 О с пр- к НаТРИЙд 0 дЕЦИПСУПЬФ 3 Тдэ 12 деКСТРаН 5 геном определяют по методу Максама.10 мин при 25 С В смеси, содержащей В 51 11 фрагмент) и сравнивают с опу 2 ММЧЛЬ ЭТИЛЭНДНННТРИПОТЕТРЗУКсусной бликованной 1 РЫрпоследовательнот-5 МГ/МЛ ТРКэ 3 аТ 9 М 5 МИ 6000 В - Выяснилось, оба клона на 5 конч смеси 2.ммоль этилендинитрилотетра це не имеют полной 1 ГЫ-рпоследовач.тельности, у них отсутствуют приблич рийдодецилсульфата 1 декстрансульФата 5 Ш/Мл ТРНк затем 5 Мин 15 днрующего для зрелого протеина. У ПРИ 60 С В 2 ММ 0 дЬ ЭТИЛеНдИНИТРНЛ 0 3 Нконца Р 1 Р 12 является полнымгР 2 Н 10 тетрауксусной кислоты, рН 8,0, 0,2 также содержит весь 3 трегион жги-р-. натрийдОдВЦИПСУЛЪФ 8 Та 5 р 1 Г/МЛ ТРНк- ткДЩК включая поли(А)последовательД мин элюируют при 10000 в 1 мл Н 10. 20 Р 2 Н 10 простирается однако еще замет с 10 шт ттРНК. После хроматографни нее (1400 п.о.), 3 поли(А 1 лежит в на олиго(Т)-целлюлозной колонке одной области с последовательностью РНК осаждают этанолом, вносят в олиго(С), следуя от последователь т 5 мл Н 20 и ннъецируют в ооциты Хе ности неизвестного происхождения, ана порпе 1 аеч 15, Ооциты лослеинкубации 25 лиз ДНКпоследовательиости различных1 в течение 2 дней при комнатной темы 1 отрезков этого дополнительного реги 1 пературе испытывают методом подсчета она Р 2 Н 10 не дает гомологии с 1 ГЫБ-7 стерильным бляшек на активность ин геном. Перекрестно гибридизированные терферонад Д 0- с клоном Р 2 Н 10 клоны Р 1 С 12 и Е 52 Е 1Подтвердилась, что клоны Р 1 Г 12 и 30 гибридизиррются и с дополнительным Р 2 Н 1 О несут вставку интерферонднк. регионои.Р 2 Н 10 а не с частью 1 Пр. В таблице приведены результаты П р и м е р 8. Клон Р 1 А 6 гибридит испытанй. 1 р. эируют с.вирусиндуцированной намальванРНК в регионе 1214 5. Он содерт жит вставку кДК приблизительно 900 п.о., которая, как показал ре стрикционный анализ, не имеет сайтаР 1 Г 13 т 50 98 - ность получают путем анализа.ДНК т 1 последовательности последователен Р 2 Н 10 н 50 Ы 198 ность кднктвставки Р 1 А 6 определяют р 1 - . сравнением с 1 РПтцгпоследовательно рн 1 -2 е . - 45 стью. 0 казалось,что клон Р 1 А 6 содер с нит на 49 пар оснований более корот Р 2 В 10 (2 т кий вариант-Ье 1 ГШС.Наличие поли(А). указывает на то, что клон Р 2 Абпрот 50 нзошел от более короткой иРНК, чем опубликованный клон Ье 1 ГЫ С.Регион кодирования Ъе 1 ГЫ С, содержится в плазммдной ДНК.П ри м е р 7.-Исследуют вставки кДНК клона Р 1 Г 12 и Р 2 Н 10 с помощъю рестрикционной эндонуклеазы, причем определяют наличие сайтов-рестрикции зндонуклеаз ВешН 1, В 31 11, Есо Е 1 55 П р и м е р 9. Клон Р 1 А 6 един Н 1 па 111, ЕБЪ 1 и Рти 11. Сравнивают ственный ШРЫ-мгтип клона индентифи рестрикционные карты Р 1 Г 12 и Р 2 Н 10 - цируют из коллекции 190 тридекануе с известны на литературы геном для клеотидпозитивныщ кленов. Гибридит.1 гпр Всетри клона имеют Ртц 11, зуют 1800 клонов первоначального