7,9-Диоксо-10-метил-11-окса-13-аза-1-гомопрост-8(12)-ен, обладающий иммуносупрессивной активностью

(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Голубева Марина Брониславовна Кузьмицкий Болеслав Бронеславович Лахвич Федор Адамович Любин Геннадий Семенович Пашковский Феликс Сигизмундович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) ПАШКОВСКИЙ Ф.С. и др. Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус,сер. хм. навук, 2009. -2. - С. 57-62. КУЗЬМИЦКИЙ Б.Б. и др. Биорегуляторы исследование и применение, 2008. Вып. 2. - С. 33-39... . . . . 1990. - . 322. - . 17. - . 1183-1188.10155 1, 2007. обладающий иммуносупрессивной активностью. Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к новому веществу - синтетическому аналогу простагландина 1 со структурной формулой , которое может быть использовано в качестве иммуносупрессора в фармации и медицине,Молекулярная формула 20353. Молекулярная масса 337 г/моль. Известен синтетический аналог простагландина 1 мизопростол, который наряду с гастропротекторным эффектом обладает мягкой иммуносупрессивной активностью, но недостаточной для обеспечения клинически значимой эффективности 1, 2. являющееся изомером заявляемого гетеропростаноида , которое обладает иммуностимулирующей активностью 3. Синтетических аналогов простагландина 1, проявляющих иммуносупрессивную активность на уровне корректора течения заболеваний, связанных с гиперчувствительностью иммунной системы, в доступных патентных и литературных источниках не выявлено. Задача изобретения - новый синтетический аналог простагландина 1, обладающий в фармакологически реальных дозах иммуносупрессивной активностью. Поставленная задача решается заявляемым соединением - 7,9-диоксо-10-метил-11 окса-13-аза-1-гомопрост-8(12)-еном , которое характеризуется наличием кетогрупп в положениях 7 и 9, метильной группы в положении 10, атома кислорода в положении 11,-группы в положении 13, удлинением -цепи на одно метиленовое звено, а также отсутствием терминальной карбоксифункции в -цепи, транс-13(14)-двойной связи и 15 гидроксигруппы в -цепи по сравнению с простагландином 1. Способ получения заявляемого соединения приведен на схеме 1 и подтверждается примером его выполнения. Схема 1 15448 1 2012.02.28 Пример. Способ получения заявляемого соединения. Стадия 1. Получение 3-каприлоил-5-метилтетроновой кислоты . К 1,03 г (9 ммоль) 5-метилтетроновой кислотыв безводном хлористом метилене(0 С) при перемешивании приливают 1,38 мл (9,9 ммоль) триэтиламина. К образовавшемуся раствору триэтиламмонийной соли последовательно добавляют 4-(диметиламино)пиридин(0,36 г, 2,97 ммоль), 1,56 мл (9,9 ммоль) каприловой кислоты и, наконец, по порциям дициклогексилкарбодиимид (2,22 г, 10,8 ммоль). Охлаждение убирают и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 15 ч. Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают и промывают этилацетатом. Объединенные фильтраты упаривают. К остатку добавляют 80 мл диэтилового эфира, 25 мл 1,5 н.и полученную смесь встряхивают в делительной воронке. После отделения водного слоя органическую фазу промывают 1,5 н.(20 мл) и водой (20 мл), сушат 4. После выпаривания растворителя продукт реакции очищают на колонке с силикагелем (гексан-эфир, градиентное элюирование) и перекристаллизовывают. Выход 81 . Т. пл. 39-41 С (эфир). ИК-спектр , , см-1 1475, 1595 пл., 1620 (макс.), 1675, 1685 пл., 1760. Спектр ЯМР 1 (3),м.д., (, Гц) 0,90 т (3, 3,6,5), 1,18-1,46 м (8, 42),1,53 д (3, 3,7,0), 1,71 квинтет 2, 22,7,5, 2,92 т 2, 2,7,5, 4,80 м (1, 3), 9,38 ушир. сигнал (1,енола). Масс-спектр 240 (М). Вычислено для 13204. Мол. мас. 240,30 г/моль. Стадия 2. Получение смеси региоизомерных метиловых енольных эфиров ( и ). К раствору 0,48 г (2 ммоль) -трикарбонильного соединенияв 10 мл диэтилового эфира при перемешивании по порциям добавляют эфирный раствор диазометана, полученный при обработке -нитрозометилмочевины 40 -ным водным раствором гидроксида калия. По окончании выделения пузырьков газа и обесцвечивания реакционной смеси последнюю выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель упаривают в вакууме, получив в остатке 0,51 г смеси региоизомерных енольных эфиров (, ),которые без очистки и разделения вводят в стадию 3. Стадия 3. Синтез 7,9-диоксо-10-метил-11-окса-13-аза-1-гомопрост-8(12)-ена . К 0,51 г смеси енольных эфиров (, ) приливают 5 мл (33,3 ммоль) гептиламина. Реакционную смесь выдерживают при 80-100 С до окончания реакции (контроль методом тонкослойной хроматографии). К охлажденной реакционной смеси добавляют 50 мл хлороформа, 50 мл 1,5 н. соляной кислоты и полученную смесь встряхивают в делительной воронке. После отделения водного слоя органическую фазу промывают 1,5 н.(25 мл) и водой (50 мл), сушат сульфатом натрия. После выпаривания растворителя продукты реакции разделяют на колонке с силикагелем (элюент - эфир-петролейный эфир, градиентное элюирование). Соединение(0,074 г) выделяют в виде белого кристаллического вещества. Выход 11 в расчете на -трикарбонильное соединение . Т. пл. 44-45 С(этилацетат). ИК-спектр , , см-1 1505, 1515 пл, 1600, 1640 (макс.). Спектр ЯМР 1 (3),м.д., (, Гц) 0,87 т 0,89 т (6, 23 - и -цепей,7,0),1,22-1,40 м (16, 82), 1,50 д (3, 3,7,0), 1,57-1,66 м (4, 22), 2,78-2,89 м (2,2), 3,42 к (2,7,0), 4,64 к (1, 3,7,0), 9,26 ушир.т (1, ). Спектр ЯМР 13 (3),м.д. 14,02 (3), 14,09 (3), 16,89 (3), 22,54 (2),22,64 (2), 24,32 (2), 26,60 (2), 28,74 (2), 29,19 (2), 29,40 (2), 29,46 (2),31,61 (2), 31,76 (2), 39,97 (2), 40,91 (2), 83,43 , 95,00 (Счетв.), 176,91 (Счетв.),192,66 (Счетв.), 197,77 (Счетв.). Масс-спектр 337 (М). Вычислено для 20353. Мол. мас. 337,5 г/моль. Заявляемое соединение в дозах 2,5 и 5 мкг/кг в желудок проявляет иммуносупрессивную активность. В диапазоне доз 2-7 мкг/кг дозозависимость эффекта приближается к линейной. С увеличением дозы соединения иммуносупрессивная активность не усиливается или же снижается. 3 15448 1 2012.02.28 В отличие от иммуносупрессоров-цитостатиков, подавляющих иммунные реакции в целом, заявляемое соединение обладает избирательной супрессивной активностью. Соединение угнетает иммунные реакции в лимфоидных (иммунокомпетентных) клетках,существенно не влияет на неспецифические эффекторы клеточного иммунитета, слабо тормозит выработку антителообразующих клеток в селезенке, но не оказывает влияния на процесс образования антител плазматическими клетками. Заявляемое соединение прежде всего угнетает кооперативные реакции -клеточного иммунитета, блокируя быструю активацию -лимфоцитов под влиянием антигена и способность активированных клеток продуцировать провоспалительные цитокины, тормозит образование антиген-антительных комплексов и активацию под их влиянием комплемента, что опосредует угнетение острой воспалительной реакции. Заявляемое соединение практически нетоксично. Его 502500 мг/кг интрагастрально. 50 при том же пути введения составляет 2,5 мкг/кг. Индекс широты фармакологического действия приближается к 1 000 000. Гетеропростаноидможет быть использован в фармации и медицине в качестве корректора течения заболеваний, связанных с гиперчувствительностью иммунной системы к чужеродному антигену. Прогнозируется, что достаточно высокая избирательность действия и относительная безопасность иммуносупрессора нивелируют его возможные побочные эффекты (гематотоксичность, подавление общих защитных функций организма,активацию вторичной инфекции и др.). Иммуносупрессивную активность заявляемого соединения оценивали с помощью стандартных методов доклинического испытания фармакологических веществ в соответствии с требованиями Правил надлежащей лабораторной практики 3. Для оценки вектора и величины действия заявляемого соединения на иммунные реакции использовали индекс супрессии (ИС) иммунного ответа, выражаемый величиной отношения О/К 100 . Статистическую обработку результатов испытаний провели путем определения медианы и стандартной ошибки. Достоверность различий оценивали по критериюСтьюдента 4. Дозозависимость иммуносупрессивной активности заявляемого соединения и величины ИС специфических и неспецифических иммунологических показателейпредставлены в таблице. 1. Влияние заявляемого соединения на кооперативные реакции клеточного иммунитета на модели гиперчувствительности замедленного типа у мышей. Мышей-гибридов (СВАС 57 В/6)1 сенсибилизируют эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 8105 клеток/мышь в объеме 200 мкл внутривенно. На 5-й день после сенсибилизации мышам вводят разрешающую дозу антигена 1108 клеток на мышь в объеме 20 мкл под апоневроз одной из задних конечностей. В контрлатеральную (контрольную) лапу вводят такой же объем растворителя. Спустя 24 часа после введения разрешающей дозы антигена измеряют величину сформировавшейся на месте инъекции воспалительной реакции (по разнице объемов опытной и контрольной лап). Индекс реакции определяют по формуле К 100 . К Тестируемое соединение вводят в дозах 2,5 и 5,0 мкг/кг внутрижелудочно одновременно с введением сенсибилизирующей дозы антигена. Результаты исследований иммунного ответа показали (таблица, пп. 1.1, 1.2), что величины ИС во всех случаях отрицательные. Следовательно, заявляемое соединение проявляет иммуносупрессивную активность. Видно, что после введения соединения (2,5 и 5,0 мкг/кг в/ж) одновременно с сенсибилизирующей дозой антигена имеет место угнетение реакции ГЗТ на 45-57 по сравнению с контролем. Выраженность реакции ГЗТ также уменьшается на 40-50 после введения заявляемого соединения в тех же дозах одновременно с разрешающей дозой антигена, что свидетельствует о его способности ингибировать секрецию провоспалительных цитокинов. 4 15448 1 2012.02.28 Таким образом, заявляемое соединение проявляет дозозависимую иммуносупрессивную активность, подавляя процесс образования клона активированных -лимфоцитов и способность этих клеток при встрече с антигеном продуцировать провоспалительные цитокины. 2. Влияние заявляемого соединения на модели гиперчувствительности типа феномена Артюса у мышей. Мышей-гибридов (СВАС 57 В/6)1, самцов массой тела 20-30 г, сенсибилизируют суспензией ЭБ в дозе 2107 клеток/мышь в объеме 0,2 мл фосфатного буфера подкожно в межлопаточную область. Спустя 4 суток животным вводят разрешающую дозу антигена(1108 клеток/мышь) в объеме 40 мкл субплантарно в правую лапу. Левая лапа - контрольная. Тестируемое соединение вводят животным опытных групп в дозах 2,5 и 5,0 мкг/кг внутрижелудочно однократно за 24 и 1 час до введения разрешающей дозы антигена. Через сутки после инъекции второй дозы антигена измеряют объемы правой и левой лап с помощью микрометра. Торможение реакции гиперчувствительности данного типа вычисляют по формулел Представленные данные (таблица, пп. 2.1, 2.2) доказывают, что после введения заявляемого соединения (2,5 и 5,0 мкг/кг в/ж) за 24 часа до разрешающей дозы антигена острое гипериммунное воспаление типа феномена Артюса угнетается на 54-59 по сравнению с нелеченными животными. В то же время при введении заявляемого соединения за 1 час до разрешающей дозы антигена проявление воспалительной реакции практически не изменяется. Таким образом, заявляемое соединение угнетает острое гипериммунное воспаление,опосредованное накоплением иммунных комплексов в тканях и активацией под их влиянием комплемента. 3. Влияние заявляемого соединения на реакцию -клеточного (гуморального) иммунитета. 3.1. Влияние заявляемого соединения на количество антителообразующих клеток в селезенке. Мышей линии СВА иммунизируют эритроцитами барана (ЭБ). Иммунизирующая доза антигена 1107 клеток/мышь в объеме 0,5 мл внутрибрюшинно. Тотчас мышам опытных групп вводят тестируемое соединение (2,5 и 5,0 мкг/кг в/ж) в объеме 0,2 мл с помощью иглы-зонда с оливой. Контрольным животным вводят тем же путем адекватное количество растворителя. На 5-е сутки с помощью модифицированного метода локального гемолиза определяют количество антителообразующих клеток (АОК) в селезенке, массу органа и общее количество ядросодержащих клеток. Первичные результаты исследования выражают количеством АОК на 106 ядросодержащих клеток и на всю селезенку. Затем определяют индекс модуляции (ИМ) иммунного ответа величиной О/К 100 . Результаты испытания, представленные в таблице (п. 3.1), свидетельствуют о том, что заявляемое соединение в дозе 5 мкг/кг достоверно уменьшает количество АОК в селезенках мышей, иммунизированных ЭБ, индекс супрессии не превышает 30-35 . С увеличением дозы соединения до 10 мкг/кг супрессивный эффект не усиливается. Таким образом, заявляемое соединение оказывает неглубокое супрессивное влияние на -клеточное звено иммунитета. 3.2. Влияние заявляемого соединения на титры гемагглютининов в крови иммунизированных мышей. Мышам линии СВА вводят тестируемое соединение (2,5 и 5 мкг/кг в/ж), контрольным животным вводят адекватное количество растворителя. Тотчас всех животных иммунизируют (ЭБ в дозе 1107 клеток/мышь в/б). Через 7 дней получают сыворотку крови декапти 5 15448 1 2012.02.28 рованных мышей. Комплемент сыворотки инактивируют прогреванием в течение 30 мин при температуре 56 С. Реакцию гемагглютинации изучают в микротитраторе. В лунках планшета готовят разведения каждого образца сыворотки крови. В каждую лунку добавляют ЭБ в дозе 2105 клеток. Планшеты встряхивают и ставят в термостат при температуре 37 С на 2 часа. Титр -антител выражают величиной , где- последняя в ряду разведений сыворотка, в которой наблюдается отчетливая агглютинация ЭБ. Результаты исследований подтверждают, что заявляемое соединение в диапазоне испытанных доз на титры -антител в крови иммунизированных ЭБ мышей не оказывает влияния, но тормозит на 30 преобразование В-клеток в полноценные антителообразующие клетки (таблица, п. 3.1, 3.2). 4. Влияние заявляемого соединения на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов. Мышам популяции , самцам, массой 24-25 г, вводят тестируемое вещество в дозах 2,5 и 5 мкг/кг внутрижелудочно однократно. Животные контрольной группы получают адекватное количество растворителя. Через 24 часа мышам всех групп вводят внутрибрюшинно 0,05 суспензию коллоидной туши в объеме 2 мл. Спустя 10 мин брюшную полость промывают 5 мл раствора 0,9 . Полученные клетки перитонеального экссудата трижды отмывают и ресуспендируют в 1-2 мл раствора 0,9 . Подсчитывают концентрацию ядросодержащих клеток (ЯСК) и процент фагоцитирующих клеток. Затем клетки осаждают центрифугированием, супернатант удаляют, а осадок КПЭ лизируют дистиллированной водой. Лизат помещают в плоскодонные планшеты и с помощью ридера для многолуночных планшетов 200 (, Австрия) при длине волны 620 нм измеряют оптическую плотность, которая отражает количество туши, поглощенной фагоцитами. По калибровочной кривой рассчитывают количество поглощенной туши. Данные, приведенные в таблице, свидетельствуют о том, что заявляемое соединение заметного влияния на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов не оказывает. После его введения в дозах 2,5, 5 и 10 мкг/кг общее количество ЯСК, количество фагоцитирующих клеток, их поглотительная способность и фагоцитарный индекс достоверно не изменяются (таблица, пп. 4.1- 4.4). Дозозависимость иммуносупрессивного влияния заявляемого соединения и величины индексов супрессии специфических и неспецифических иммунологических показателей,Доза, мкг/кг, в/б Иммунологический показатель 2,5 5,0 1. Кооперативные реакции клеточного иммунитета 1.1. Реакция гиперчувствительности замедленного типа после введения-57 соединения одновременно с сенсибилизирующей дозой антигена 1.2. Реакция гиперчувствительности замедленного типа после введения-40 соединения одновременно с разрешающей дозой антигена 2. Реакция гиперчувствительности типа феномена Артюса 2.1. Реакция гиперчувствительности типа феномена Артюса после вве-54-59 дения соединения за 24 часа до разрешающей дозы антигена 2.2. Реакция гиперчувствительности типа феномена Артюса после вве-8-6 дения соединения за 1 час до разрешающей дозы антигена 3. Реакции В-клеточного (гуморального) иммунитета 3.1. Количество антителообразующих клеток (на 106 спленоцитов) в-35 селезенке мышей, иммунизированных эритроцитами барана 3.2. Титры сывороточных -антител к эритроцитам барана 0 0 15448 1 2012.02.28 Продолжение таблицы Иммунологический показатель 4. Фагоцитарная активность перитонеальных макрофагов 4.1. Количество ЯСК в перитонеальном экссудате 4.2. Процент фагоцитирующих клеток 4.3. Поглотительная способность клеток ПЭ 4.4. Фагоцитарный индекс Источники информации 1..,,-// . . . . - 1990. - . 322. - . 1183-1188. 2.,// . . . . . - 2005. - . 38. - . 12. - . 1759-1768. 3. Заявка на получение патента РБ 20100407, 2010. 4. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - М., 2000. - С. 36, 246, 258-259, 360-385. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7