7,9-Диоксо-10-окса-11-метил-13-аза-1-гомопрост-8(12)-ен, обладающий иммуностимулирующей активностью

(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Голубева Марина Брониславовна Кузьмицкий Болеслав Брониславович Лахвич Федор Адамович Любин Геннадий Семенович Пашковский Феликс Сигизмундович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) ПАШКОВСКИЙ Ф.С. и др. // Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус. Сер. хм. навук. - 2009. -2. - С. 57-62. ЛЮБИН Г.С. и др. // Химико-фармацевтический журнал. - 2007. - Т. 41, 11. - С. 11-18.10155 1, 2007.8987 1, 2007.4239778, 1980.6417228 1, 2002. Изобретение относится к области биоорганической химии, в частности к новому веществу - синтетическому аналогу простагландина 1 со структурной формулой , которое может быть использовано в качестве иммуностимулятора в фармации и медицине. Химическое наименование заявляемого соединения 7,9-диоксо-10-окса-11-метил-13 аза-1-гомопрост-8(12)-ен. 14662 1 2011.08.30 Молекулярная формула 20353. Молекулярная масса 337 г/моль. Известно соединение, которое относится к ряду 13-азапростаноидов и обладает высокой иммуностимулирующей активностью 1, но не является структурным аналогом соединения . Задача изобретения - новый синтетический аналог простагландина 1, обладающий фармакологически реальной иммуностимулирующей активностью. Поставленная задача решается заявляемым соединением - 7,9-диоксо-10-окса-11 метил-13-аза-1-гомопрост-8(12)-еном , который характеризуется наличием кетогрупп в положениях 7 и 9, атома кислорода в положении 10, метильной группы в положении 11,-группы в положении 13, удлинением -цепи на одно метиленовое звено, а также отсутствием терминальной карбоксифункции в -цепи, транс-13(14)-двойной связи и 15 гидроксигруппы в -цепи. Способ получения заявляемого соединения приведен на схеме 1 и подтверждается примером его выполнения. Схема 1. Пример. Способ получения заявляемого соединения. Стадия 1. Получение 3-каприлоил-5-метилтетроновой кислоты . К 1,03 г (9 ммоль) 5-метилтетроновой кислотыв безводном хлористом метилене(0 С) при перемешивании приливают 1,38 мл (9,9 ммоль) триэтиламина. К образовавшемуся раствору триэтиламмонийной соли последовательно добавляют 42(диметиламино)пиридин (0,36 г, 2,97 ммоль), 1,56 мл (9,9 ммоль) каприловой кислоты и,наконец, по порциям - дициклогексилкарбодиимид (2,22 г, 10,8 ммоль). Охлаждение убирают и реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре 15 ч. Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают и промывают этилацетатом. Объединенные фильтраты упаривают. К остатку добавляют 80 мл диэтилового эфира, 25 мл 1,5 н.и полученную смесь встряхивают в делительной воронке. После отделения водного слоя органическую фазу промывают 1,5 н.(20 мл) и водой (20 мл), сушат 4. После выпаривания растворителя продукт реакции очищают на колонке с силикагелем (гексан эфир, градиентное элюирование) и перекристаллизовывают. Выход 81 . Т. пл. 39-41 С(эфир). ИК-спектр , , см-1 1475, 1595 пл., 1620 (макс.), 1675, 1685 пл., 1760. Спектр ЯМР 1 (3),м.д., (, Гц) 0,90 т (3, 3,6,5), 1,18-1,46 м (8, 42),1,53 д (3 Н, 3,7,0), 1,71 квинтет 2 Н, 22,7,5, 2,92 т 2 Н, 2,7,5, 4,80 м (1, 3), 9,38 ушир. сигнал (1,енола). Масс-спектр 240 . Вычислено для 13204. Мол. мас. 240,30 г/моль. Стадия 2. Получение смеси региоизомерных метиловых енольных эфиров ( и ). К раствору 0,48 г (2 ммоль) -трикарбонильного соединенияв 10 мл диэтилового эфира при перемешивании по порциям добавляют эфирный раствор диазометана, полученный при обработке -нитрозометилмочевины 40 -ным водным раствором щелочи. По окончании выделения пузырьков газа и обесцвечивания реакционной смеси последнюю выдерживают при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель упаривают в вакууме, получив в остатке 0,51 г смеси региоизомерных енольных эфиров (, ), которые без очистки и разделения вводят в стадию 3. Стадия 3. Синтез 7,9-диоксо-10-окса-11-метил-13-аза-1-гомопрост-8(12)-ена . К 0,51 г смеси енольных эфиров (, ) приливают 5 мл (33,3 ммоль) гептиламина. Реакционную смесь выдерживают при 80-100 С до окончания реакции (контроль методом тонкослойной хроматографии). К охлажденной реакционной смеси добавляют 50 мл хлороформа, 50 мл 1,5 н. соляной кислоты и полученную смесь встряхивают в делительной воронке. После отделения водного слоя органическую фазу промывают 1,5 н.(25 мл) и водой (50 мл), сушат сульфатом натрия. После выпаривания растворителя продукты реакции разделяют на колонке с силикагелем (элюент - эфир-петролейный эфир, градиентное элюирование). Целевое соединение(0,17 г) выделяют в виде маслообразного вещества желтого цвета. Выход 25 в расчете на -трикарбонильное соединение . ИК-спектр (пленка), , см-1 1465, 1495, 1595, 1640 (макс.), 1740. Спектр ЯМР 1 (3),м.д, (, Гц) 0,87 т 0,89 т (6 Н, 23 - и -цепей,7,0),1,20-1,41 м (16 Н, 82), 1,57 д (3 Н, 3,6,5), 1,61 квинтет (2, 2,7,5), 1,68 квинтет (2 Н, 2,7,5), 2,87 т 2 Н, 2,7,5, 3,27 секстет (1,7,0), 3,35 секстет (1,7,0), 5,01 к (1, 3,6,5), 9,73 ушир. сигнал (1, ). Спектр ЯМР 13 (3),м.д 14,04 (3), 14,12 (3), 19,02 (3), 22,54 (2),22,66 (2), 24,22 (2), 26,57 (2), 28,81 (2), 29,23 (2), 29,34 (2), 30,01 (2),31,57 (2), 31,76 (2), 39,65 (2), 45,01 (2), 71,07 , 94,44 (Счетв), 170,24 (Счетв),176,86 (Счетв), 199,91 (Счетв). Масс-спектр 337 . Вычислено для 20353. Мол. мас. 337,5 г/моль. Иммунофармакологическая активность заявляемого соединения испытана экспериментально с использованием комплекса стандартных методик, которые позволяют оценить иммунотропный эффект изучаемого вещества и идентифицировать то звено иммунитета, на которое действует данное вещество 2. Результаты испытания в опытных и контрольных группах животных обработаны, сравнены и оценены статистически с использованием параметрического метода и критерияСтьюдента и представлены в табл. 1-3. Результаты испытаний, представленные в табл. 1, свидетельствуют о том, что заявляемое соединение в дозах 2,5-5,0 мкг/кг внутрь активирует -клеточное (гуморальное) зве 3 14662 1 2011.08.30 но иммунитета как у высокореагирующих на антиген эритроцитов барана (ЭБ) мышей линии , так и у слабореагирующих на тот антиген мышей линии 57/6. Минимальная экспериментальная терапевтическая доза заявляемого соединения составляет 2,5 мкг/кг внутрь (в желудок). Стимулирующий эффект соединения достигает максимума при введении в дозе 5 мкг/кг в индуктивную фазу иммуногенеза. Дальнейшее увеличение тестируемой дозы заявляемого соединения приводит к ослаблению эффекта, но стимулирующий вектор действия его на иммунную систему в реальном диапазоне фармакологических доз не претерпевает реверсию на супрессивный, что отличает заявляемое соединение от известных химических иммуномодуляторов. В табл. 1 представлены также данные, показывающие, что заявляемое соединение активирует -клеточноопосредованный иммунный ответ в реакции гиперчувствительности замедленного типа (РГЗТ). Индекс РГЗТ (5 мкг/кг) увеличивается на 50 по сравнению с иммунизированным контролем, если вещество вводится одновременно с сенсибилизирующей дозой антигена. В табл. 2 представлены результаты испытания влияния заявляемого соединения на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов в опытах на мышах. Очевидно, что заявляемое соединение в дозах 2,5-5 мкг/кг усиливает спонтанную и хемотаксическую (направленную) миграцию перитонеальных макрофагов. С увеличением дозы соединения жизнеспособность макрофагов оптимизируется с 91 в контрольных сериях до 94 после введения соединения в дозе 5 мкг/кг. Таким образом, заявляемое соединение активирует формирование клона антигенспецифической субпопуляции регуляторных Т-лимфоцитов и клона антигенспецифических-лимфоцитов, образование которых протекает под влиянием Т-хелперов, а также усиливает спонтанную и хемотаксическую миграцию фагоцитирующих перитонеальных макрофагов, что свидетельствует о влиянии соединения не только на специфический, но и на неспецифический иммунитет. В табл. 3 представлены результаты испытания иммунотерапевтической эффективности заявляемого соединения в условиях моделирования иммунодефицита у мышей-самок линии . После введения животным циклофосфамида (10 мг/кг п/к ежедневно в течение 3 дней) угнетаются все показатели гуморального иммунного ответа. Очевидно, что следствием коррекции индуцированного иммунодефицита под влиянием соединения(5 мкг/кг в/ж однократно) является восстановление относительного и абсолютного количества АОК на 85 по сравнению с нелеченным контролем. Показано, что в случае острого облучения мышей в дозе 30 сГр имеет место супрессия всех показателей Вклеточного звена иммунитета. Восстановление относительного и абсолютного содержания АОК в селезенке под влиянием заявляемого соединения достигает 170-180 , селезеночного индекса - на 52 по сравнению с облученными животными, и эти показатели практически выходят на уровень показателей у нормометрических животных. Исследование токсичности заявляемого соединенияпроводили на мышах 3. Испытываемые дозы подбирались так, что каждая последующая отличается от предыдущей в 1,5 раза, причем каждую дозу вводили только одному животному. Для мышейвыбрана следующая шкала доз заявляемого соединения 750, 1130, 1690, 2540, 3810, 5000 мг/кг. Поскольку ни одна из введенных доз, включая максимальную по техническим возможностям, не вызвала гибели мышей при введении внутрибрюшинно, предварительная оценка токсичности заявляемого соединения позволяет заключить, что оно относится кклассу практически нетоксичных коммерческих продуктов 4.(49) Относительный коэффициент се 4,60,4 4,30,2 4,20,3 4,20,3 4,00,4 4,40,4 лезенки Титр гемагглюти 3,670,33 5,000,37 4,670,23 3,330,33 3,800,37 3,800,45 нинов(50) Примечание здесь и в табл. 2, 3 в скобках - эффект вк иммунизированному контролю 0,001,0,01,0,05 по сравнению с контролем. Таблица 2 Влияние соединенияна жизнеспособность и подвижность перитонеальных макрофагов мышейв опытах(,7) Влияние соединения, введенного однократно внутрь, мкг/кг Показатель фагоцитарной активности Контроль 2,5 5,0 Жизнеспособность ПМБ,91,02,5 93,01,8 94,01,6 Спонтанная двигательная активность, ко 22,91,5 25,61,4 12,20,96 личество клеток Иммунотерапевтическая эффективность соединенияв дозе 5 мкг/кг в/ж однократно в условиях индуцированных иммунодефицитов у мышей-самок линии(,7) Циклофосфамид, 10 мг/кг 3 Облучение -квантами, 30 сГр однократно Показатель Контроль СоединениеКонтроль Соединение 890,041,0 587,551,0 Число АОК на 106 880,040,0 503,637,0 480,016,4 186,019,0 спленоцитов(68) Число АОК на селе 92,03,8 94,69,8 92,210,0 54,36,8 зенку 103 50,03,0 18,73,3(60)0,001,0,01,0,05 по сравнению с контролем первая строка - нормометрический контроль, вторая иммунодефицитный. 14662 1 2011.08.30 Источники информации 1. Патент РБ 10155, МПК 607 307/00,61 37/00, 2007. 2. Методические указания по изучению иммунотропной активности фармакологических веществ Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ. - ., 2000. - С. 257-263. 3.В,. // . . . - 1943. - . 25,9.- . 415. 4..,../ . Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.