Штамм бактерий Pseudomonas aurantiaca БИМ B-446Д, обладающий антагонистической активностью в отношении грибных и бактериальных патогенов растений

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БАКТЕРИЙБИМ -446 Д, ОБЛАДАЮЩИЙ АНТАГОНИСТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ В ОТНОШЕНИИ ГРИБНЫХ И БАКТЕРИАЛЬНЫХ ПАТОГЕНОВ РАСТЕНИЙ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Коломиец Эмилия Ивановна Купцов Владислав Николаевич Сверчкова Наталья Владимировна Мандрик Марина Николаевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Штамм бактерийБИМ В-446 Д, обладающий антагонистической активностью в отношении грибных и бактериальных патогенов растений. Изобретение относится к биотехнологии, в частности к разработке микробиологических средств защиты растений от болезней, и касается нового штаммаБИМ В-446 Д, эффективного против фитопатогенов грибной и бактериальной природы. Известен штамм 51 - антагонист грибов, ,,,,возбудителей заболеваний пшеницы. Однако, характеризуясь выраженной антифунгальной активностью, штамм не способен контролировать развитие болезней растений бактериальной этиологии 1. Известен штаммВ-1743 Д, способный подавлять рост фитопатогенных грибов родаи бактерий . Тем не менее следует отметить, что спектр антагонистической активности культуры сравнительно узкий, штаммВ-1743 Д неэффективен против важных сельскохозяйственных фитопатогенов родов , , , , , ,и 2. Известен штамм-6615, обладающий способностью стимулировать рост растений, ингибировать рост фитопатогенных грибов, ,,,, защищать от почвенных патогенов в процессе вегетации и хранения. Однако отсутствуют сведения об антибактериальной активности штамма, кроме того, для культивирования бактерий ис 12761 1 2009.12.30 пользуется дорогостоящая питательная среда с мясопептонным бульоном (МПБ), что не приемлемо для промышленного производства 3. Наиболее близким к заявляемому является бактериальный штамм 469, рекомендованный для подавления широкого спектра патогенов растений,включая грибы и бактерии родов , , , , ,и 4. К основным недостаткам штамма-прототипа относится 1) сравнительно невысокая антагонистическая активность в отношении большинства испытанных грибных и бактериальных патогенов (угнетение роста мицелия гриба только в местах соприкосновения с бактериальным штрихом диаметр зон задержки роста бактериальных патогенов 15-20 мм) 2) отсутствие данных о способности штамма контролировать развитие таких вредоносных фитопатогенов, как , , , , 3) для культивирования штамма используются дорогостоящие питательные среды ЛВ, в состав которой входит триптон и дрожжевой экстракт, МПБ, Кинга Б, минимальная синтетическая среда М 9 с глюкозой 4) нет данных о способности штамма утилизировать дешевые многокомпонентные субстраты типа осадка городских сточных вод (ОГСВ), загрязняющие окружающую среду. Целью изобретения является получение нового штамма бактерий, характеризующегося комплексной антагонистической активностью в отношении грибных и бактериальных патогенов растений и способного к росту на дешевом субстрате - осадке городских сточных вод, рациональное использование которого будет способствовать охране окружающей среды. Указанная цель достигается путем получения штамма .БИМ В-446 Д, характеризующегося высокой антифунгальной и антибактериальной активностями, а также способностью к росту и продукции антимикробных метаболитов на ОГСВ, что, с одной стороны, удешевляет процесс ферментации, а с другой, способствует решению экологических проблем, связанных с утилизацией осадка городских сточных вод. Штамм .БИМ В-446 Д выделен из лигниноцеллюлозных отходов методом накопительной культуры на среде с гумином. 1 г лигниноцеллюлозных отходов вносили в среду, содержащую в качестве единственного источника углерода гумин и солевой состав среды Мейнелла (2 НРО 4 - 7,0 Н 2 РО 4 - 3,0 4 - 0,1 (4)24 - 1,0) и культивировали в течение 1 недели на качалке (200 обр/мин) с последующим высевом на аналогичные агаризованные среды с гумином. Штамм депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси под регистрационным номером БИМ В-446 Д. Культура также поддерживается в коллекции лаборатории средств биологического контроля ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм хранится при 4 С на агаризованной среде с МПБ (МПА), рН 7,0-7,2 перевивка - 1 раз в 6 месяцев. Культурально-морфологические свойства. Колонии на МПА 3-5 мм в диаметре, круглые, выпуклые, с ровным краем, прозрачные, просвечиваются в проходящем свете. Окраска колоний и среды может варьировать в зависимости от питательной среды и возраста культуры. Может синтезировать несколько пигментов. Так, на МПА, среде Чапека штамм синтезирует желто-зеленый, флюоресцирующий в УФ пигмент, растворимый в воде, который окрашивает питательную среду в соответствующий цвет. На среде Кинд Б синтезирует оранжевый пигмент, также выделяемый в среду, растворимый в воде и спирте. Клетки прямые или слабо изогнутые палочки 0,39-0,451,4-4,1 мм, одиночные, в парах, реже в коротких цепочках. Характер подвижности клеток соответствует полюсному расположению жгутиков. Грамотрицательные. 2 12761 1 2009.12.30 Физиолого-биохимические свойства. Штамм хорошо растет на натуральных (МПА) и синтетических (Чапека) средах, не нуждаясь в факторах роста. В качестве источника азота может использовать пептоны, соли аммония или нитратов. В качестве источников углерода - пептоны, глюкозу, сахарозу, -ксилозу, ионозит, сорбит, глюканат, цитрат, ацетат. Строгий аэроб, мезофил, не растет при 41 С. Для штамма характерны положительные тесты на оксидазу, -аргининдигидролазу, разжижение желатина, редукцию нитратов до газообразных форм азота (денитрофикацию) и отрицательные тесты на гидролиз 80, усвоение адонита и бутирата. Штамм не является патогенным, токсигенным и токсичным. Токсикологические исследования штамма проводились на белых мышах. Установлено, что при внутрижелудочном, внутрибрюшинном и интраназальном введении его суспензии во всех исследуемых концентрациях от 105 до 1010 не вызывает гибели животных. Отклонений в поведении, поедаемости корма, состоянии шерстного покрова, двигательной активности опытных животных по сравнению с контрольными не выявлено. При введении фильтрата 3-суточной жидкой культурыБИМ В-446 Д подкожно в заднюю лапку белым мышам гибели опытных животных и некроза тканей на месте введения не выявлено. Внутрибрюшное введение смыва суспензии агаровой культуры (107 микробных клеток) и убитой подогреванием при 80 С в течение 30 мин не вызывали гибели опытных животных. Проведенные исследования позволяют сделать заключение, что штамм может использоваться в микробиологическом производстве. Суть предлагаемого изобретения иллюстрируют следующие примеры. Пример 1. Для изучения спектра антимикробного действия .БИМ В-446 Д использовали метод лунок 5. Чашки Петри с 2 агаризованным бульоном Хоттингера заливали вторым слоем 1,2 агаризованного бульона Хоттингера с тест-культурой патогена, выросшей до экспоненциальной фазы роста в жидкой питательной среде. Затем сверлом(диаметром 8 мм) делали лунки, в которые вносили исследуемый антагонист. Результаты оценивали через 1-3 суток после инкубации при 28 С по зонам лизиса патогенных тесткультур (табл. 1). Культивирование антагониста проводили на модифицированной нами жидкой питательной среде Мейнелла (г/л) меласса - 30,0 24 - 7,0 КН 2 РО 4 - 3,0 4 - 0,1 цитрат натрия - 0,5 (4)24 - 1,0. Согласно полученным данным (табл. 1), штамм .БИМ В-446 Д характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении широкого спектра грибных и бактериальных патогенов растений и по большинству показателей превосходит прототип. Диаметр зон задержки роста бактериальных патогенов штаммом .БИМ В-446 Д составляет 18-27 мм, а прототипом - 15-20 мм. Антифунгальная активность штамма.БИМ В-446 Д проявляется ко всем изучаемым фитопатогенным грибам, диаметр зон задержки роста составляет 15-36 мм, прототип в основном характеризуется образованием зон угнетения мицелия гриба в месте соприкосновения с бактериальным газоном. Пример 2. Фитозащитное действие штамма .БИМ В-446 Д изучали на проростках люпина при последовательной обработке семян суспензией фитопатогенного микроорганизма (1106 КОЕ/мл) и жидкой культурой антагониста, разведенной в 10 раз, с последующей инкубацией их во влажных камерах в чашках Петри ( ) или посевом в сосуды со стерильной почвой ( ). Результаты эксперимента учитывали на 7-е сутки по интенсивности развития болезни на проростках (табл. 2, 3). Анализ результатов опыта показал,что обработка семян жидкой культурой .БИМ В-446 Д приводила к снижению развития антракноза в опытена 43 , а в опытена 73 , а развитие фузариоза подавлялось полностью в обоих экспериментах. 3 12761 1 2009.12.30 Таблица 1 Спектр антимикробной активности штамма .БИМ В-446 Д(прототип) Метод Метод Метод лунок лунок штриха/антракноз зерновых культур не иссл. 2/антракноз люпина 29,00,6 нет данных 1/серая гниль зернобобовых 36,00,5 нет данных 1/серая гниль овощных культур 26,00,4 нет данных./гельминтоспориоз злаковых 23,50,5 нет данныхВ./европейский рак плодовых 21,51,5 нет данных/фузариоз зерновых культур 31,50,5 нет данных-55043/фузариоз злаков, сухая гниль 30,50,5. /фузариоз люпина 27,51,3 нет данных./парша яблонь 25,40,5 нет данных 3/бурая пятнистость люпина 15,00,2 нет данных/кагатная гниль сахарной свеклы 32,80,5 нет данных/кагатная гниль сахарной свеклы 30,50,8 нет данных/фомозная гниль не иссл. 10-30/ризоктониоз капусты 33,50,8/резиновая гниль картофеля не иссл. 10-30 Бактериальные/фитопатогеныБИМ В-279/пустульный бактериоз сои 220,5 нет данных 1/сосудистый бактериоз капусты,18,30,5 нет данных моркови 8717/туберкулез корней овощных 21,50,5 нет данных культурБИМ В-280/бактериальный ожог сои 27,00,5 нет данных 3-3/бактериальный рак плодовых 24,51,0 нет данных 9049/бурая гниль или вилт не иссл. 15-20 картофеля.37/клубневая гниль картофеля не иссл. 15-20.115/мягкая гниль капусты не иссл. 15-20.116/мягкая гниль картофеля не иссл. 15-20.39/резиновая гниль карне иссл. 15-20 тофеля- размер зон ингибирования роста патогена определяли по диаметру, мм- зоны ингибирования роста патогена оценивались по двум параметрам- зона угнетения роста мицелия гриба в месте соприкосновения гриба с бактериальным штрихом- обширная зона угнетения роста мицелия гриба не только в месте соприкосновения с бактериальным штрихом, но и в сопредельной области. 4 12761 1 2009.12.30 Таблица 2 Эффективность фитозащитного действия разбавленной в 10 раз жидкой культуры.БИМ В-446 Д при обработке семян люпина в опытеРазвитие болезни,антракноз фузариоз Таблица 3 Эффективность фитозащитного действия разбавленной в 10 раз жидкой культуры.БИМ В-446 Д при обработке семян люпина в опытеРазвитие болезни,антракноз фузариоз Пример 3. Фитозащитное действие бактерий .БИМ В-446 Д на вегетирующие растения люпина и сои изучали при их последовательном опрыскивании споровой суспензией грибного (1106 КОЕ/мл) или культуральной жидкостью бактериального патогенов и разбавленной в 10 раз жидкой культурой антагониста в количестве 20 мл на 1 сосуд (15 растений). Результаты эксперимента учитывали на 7-е сутки по интенсивности развития болезни на вегетирующих растениях. Согласно полученным результатам, обработка всходов жидкой культурой .БИМ В-446 Д позволила снизить развитие антракноза на 42 , серой гнили на 36 и бактериального ожога на 40(табл. 4). Таблица 4 Эффективность фитозащитного действия разбавленной в 10 раз жидкой культуры.БИМ В-446 Д при обработке вегетирующих растений люпина и сои Развитие болезни,люпин соя Антагонисты бактериальный антракноз серая гниль ожог (..БИМ В-446 Д 48 64 38 Пример 4. С целью изучения способности бактерий .БИМ В-446 Д к росту и продукции антимикробных метаболитов на осадке городских сточных вод, предоставленном сотрудниками Минской очистной станции УП Минскводоканал (средний состав ОГСВ характеризуется содержанием сухие вещества (СВ) - 276,0 г/л, органические вещества(ОВ) - 66,9 СВ С - 4,5 СВ- 2,8 СВ Р 25 - 5,9 СВ, общие сахара (ОС) - 19,5 СВ, а также водорастворимые вещества - 3,3 СВ, легкогидролизуемые полисахариды 5 12761 1 2009.12.30 8,2 СВ, жиры - 9,9 СВ целлюлоза - 40,2 СВ белок - 10,6 СВ лигнин - 39,3 ),культуру выращивали в течение 4-х суток в жидкой среде с различными концентрациями ОГСВ. Анализировали титр клеток антагониста с использованием метода предельных разведений 6 и антимикробную активность методом лунок 5. Согласно данным табл. 5, штамм .БИМ В-446 Д способен расти на средах с ОГСВ в концентрациях 60-100 г/л (16-28 г/л сухих веществ (СВ, при этом его титр и антагонистическая активность достигают такого же уровня, как и на контрольной полноценной среде Мейнелла с мелассой. На основании полученных результатов можно сделать вывод о целесообразности использования ОГСВ в качестве единственного источника углерода и азота для выращивания бактерий .БИМ В-446 Д как дешевого и доступного субстрата, утилизация которого вносит вклад в решение проблем охраны окружающей среды от загрязнений. Таблица 5 Титр и антимикробная активность бактерий .БИМ В-446 Д на средах с различными концентрациями ОГСВ Диаметр зон задержки роста патогена, мм Среда культивирования Титр, 10 Пример 5. Для определения способности штамма .БИМ В-446 Д потреблять компоненты ОГСВ в процессе четырехсуточного культивирования проводился анализ количества содержания основных компонентов ОГСВ - лигнина 7, целлюлозы 8, легко- и трудногидролизуемых полисахаридов, водорастворимых (ВРВ) и экстрактивных веществ в среде 7. В результате проведенных исследований установлено, что в процессе роста культуры на ОГСВ содержание лигнина уменьшается в 1,2 раза, а целлюлозы - в 1,4 раза. Количество легкогидролизуемых полисахаридов возрастает в 1,3 раза, а трудногидролизуемых полисахаридов уменьшается в 1,2 раза. На протяжении 3-х суток культивирования происходит снижение ВРВ, а на 4-е сутки количество ВРВ резко увеличивается. Содержание экстрактивных веществ в процессе культивирования микроорганизмов на вторые сутки возрастает, а на протяжении двух последующих снижается в 1,5 раза. Полученные результаты свидетельствуют о способности штамма Р.БИМ В-446 Д к потреблению трудноутилизируемых компонентов ОГСВ. Пример 6. Потребление в процессе роста бактерий .БИМ В-446 Д трудноутилизируемых компонентов ОГСВ осуществляется благодаря способности продуцировать специфические ферменты, участвующие в разложении компонентов отходов. Ферментативную активность .БИМ В-446 Д на средах с МПБ, ОГСВ и лигнином (как трудноразлагаемым компонентом ОГСВ) анализировали спектрофотометрически с использованием хромогенных субстратов 9. Установлена способность штамма .БИМ В-446 Д продуцировать литические ферменты амилазу, протеазу, целлюлазу, пероксидазу и лакказу. Синтез амилазы и протеазы отмечен как на легко- (МПА), так и на труд 6 12761 1 2009.12.30 ноутилизируемых средах, тогда как появление целлюлазной, пероксидазной и лакказной активностей связано с деструкцией трудногидролизуемых компонентов (лигнина, целлюлозы и их производных) в процессе культивирования. Таблица 6 Ферментативная активность бактерий .БИМ В-446 Д на различных питательных средах Ферментативная активность, ед/мл целлюлаза протеаза амилаза пероксидаза МПБ 0 0,01 0,16 0 СС - солевой состав среды Мейнелла. Среда Таким образом, штамм .БИМ В-446 Д по важнейшим показателям - широкому спектру антимикробного действия по отношению к грибным (, , , , , , , , ) и бактериальным (, ) фитопатогенам,биологической эффективности, фитозащитному потенциалу, способности к продукции комплекса литических ферментов, обеспечивающих возможность его выращивания на дешевом многокомпонентном субстрате - осадке городских сточных вод, превосходит прототип и может быть использован для защиты растений от болезней грибной и бактериальной этиологии. Источники информации 1. Патент 2203945 С 1, МПК 712 1/20,01 63/00//( 12 1/20// 12 138), 2003. 2. Патент 1805849, МПК А 01 63/00, 1993. 3. Патент 2121271 С 1, МПК 601 63/00,12 1/20//( 12 1/20// 12 138), 1998. 4. Патент 2235771 С 2, МПК 712 1/20,01 63/00//( 12 1/20// 12 139),2004 (прототип). 5. Сеги Й. Методы почвенной микробиологии. - М. Колос, 1983. - С. 296. 6. Практикум по микробиологии Учебное пособие / Под ред. Н.С. Егорова. - М. Изд-во Моск. ун-та, 1976. - С. 307. 7. Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. - М. Экология, 1991. - С. 320. 8. Петербургская А.В. Практикум по агрономической химии. - Л. Колос, 1968. - С. 439. 9..., 2006. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7