Способ получения иммуногена, стимулирующего иммунную систему человека, зараженного HIV

Поставленная задача решается предлагаемым способом получения иммуногена стимулирующего иммунную систему человека,зараженното НШ, заключающимся в том, что зараженные НШ клетки выращивают в среде КРМ 1 1640 в присутствии эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 5-7-дневный супернатант фильтруют, к фильтрату добавляют Б-пропиолактон и инкубируют в течение 5 часов при З 7 С и рН среды 7,27,4, после чего замораживают, облучают гамма-лучами,размораживают, концентрируют, пропуская через ьшцпшпоровые поштсулъфоновые фильтры, очищают вначале центрифугированием с 30 ной сахарозой, затем центрифугированием в градиенте 3045-ной сахарозы, а целевой продукт получают ресуспендированием полученного осадка в РВБ буфере при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.Для пояснения изобретения приводятся фиг. 1-4, причем на фиг.1 представлена схематическая модель НЕУ.Как показано на фигд, геном РНК НП кодирует три основных структурных гена зад,ро 1 и епу, которые фдтанкированы на обоих концах длинными концевыми дупликациями(ЬТК). Ген на кодИРУет специфические белки ядра, р 55, р 39, р 24, р 17 и р 15.Гены щи кодируют обратную транскриптазу р 65/р 51 и протеазу р 31. Гены ш кодируют гликопротеин наружной мембраны 3 р 12 О и его предшественник 5 р 1 бО, а также трансмембранвьтй гликопротеин 31341. Некоторые из генов являются чрезвычайно вариабельными, в частности гены еду.Кроме того, существуют пять других генов,не присутствующих в других ретровирусах, которые либо вовлечены в транскрипционную или трансляционную регуляцию, либо кодируют другие структурные белки. Структура гена НП известна. Она описана Ратнером и др. Ыашге, 313, стр. 277 (1985).НП/ присоединяется к клеткам хозяина путем взаимодействия мембранных гликопротеинов с поверхностным рецептором клетки. Оказывается, что при контакте НП/ с клеткой Т 4 протеин 3 р 120 взаимодействует с рецептором СВ 4. Вирусная оболочка затем слияется с клеточной мембраной, и внутреннее ядро вируса входит в зараженную клетку, где транскрипция РНК в вирус ДНК катализируется обратной транскриптазой. Провирус может оставаться в клетке в латентной форме в течение нескольких месяцев или лет, и все это время зараженный индивидуум является бессимптомным. Однако, если вирус позднее активируется, вызывая вирусную репликацию и иммуносупрессию, индивидуум будет затемНа фиг. 3 представлено схематическое воспроизведение уровня некоторых антител и антигенов, присутствующих в развитии из бессимптомного состояния до состояния АКСНа фиг. 4 представлены результаты анализа по Вестерну иммуногена по примеру 1, которые показывают, что он свободен от белков наружной оболочки при скринише гомологичными и гетерологичными сыворотками, которые содержат высокие титры антитела против белков наружной оболочки. А Коммерческие полоски по Вестерну с пятнами НТУ в результате скрининга гетерологичными сыворотками шимпанзе Б Полоски по Вестерну с пятнами иммуногена в результате скрининга гетерологичными сыворотками шитшанзе В Коммерческие полоски с НИТ-пятнами по Вестерну в результате скрининга гомологичными сыворотками человека Г Полоски по Вестерну с пятнами иммуногена в результате скрининга гомологичными сыворотками человека.Как показано схематически на фиг. 3, высокие уровви антитела против 3 р 160/ 120 (наружная оболочка), которые присутствуют в бессимптомной фазе заражения НИ, также продолжают существовать в симптомной фазе. Уровень антитела р 24 в бессимптомной фазе является высоким, но, по-видимому, снижается в симптомной фазе. Аналогично НЕУ-сероположительные сыворотки содержат антитело,которое ингибирует функцию обратной транскриптазы. У пациентов, у которых антитело против обратной транскриптазы присутствует на высоких уровнях, попытки относительно выделения вируса менее часто положителъны,нежели у тех, у которых оно отсутствует. Поэтому следует, что уменьшение клетотптых и гуморальных иммунозащитных факторов, таких, как Т 4-клетки и антитела против БАБ,включая анти-р 24, и антитела против ро 1 включая антитело против обратной транскриптазы, связано с развитием НП. до спида.Используемый в данном описании термин НШ включает типы 1 и 2 и является синонимом НТЪУ-П, АХ/д и ЬАУ-2. НП/ относится к вирусу в общем смысле и включает все формы, подтипы и вариации.Используемый в данном описании термин белок наружной оболочки относится к той части мембранного гликопротеина ретровируса, которая выступает за пределы мембраны,в противоположность трансмембранному белку, 5 р 41. Белок наружной оболочки НП/ является синонимом 3 р 120 и его предшсствегшика др 1 бО.Используемый в данном описании термин 3 р 120 или 3 р 160/120 относится к гликопротеинам, имеющим либо антигенную специфичность, либо биологическую функцию белка наружной оболочки 5 р 160, как полагают, является предшественником 3 р 120.Используемый в данном описании термин генный продукт относится к полипептиду или белку, который кодируется геном. Термин,как предполагают, включает в себя белковые производные, такие, как гликопротеины. Понятно, что в аминокислотную последовательность генного продукта могут быть внесены ограниченные модификации без нарушения биологической функции или иммуногенности генного продукта, и только часть первичной последовательности может потребоваться для иммуногенности.Идентификация НШ - специфических генов и генных продуктов основана на терминологии НШ типа 1, представленной на фиг.1. Предполагается, однако, что ссылка на специфический ген или генный продукт НШ типа 1, на основе его молекулярной массы, будет также включать соответствующий ген или генный продукт НШ типа 2 и, когда присутствует гомологичный ген, другие ретровирусы. Генные продукты ДРУГИХ типов и родов могут иметь незначительно отличающиеся молекулярные массы. Например, 3 р 41 НШ типа 1 эквивалентен дрЗб типа 2, тогда как 3 р 120 типа 1 соответствует 5 р 130 типа 2.НП/ можно культивировать из пробы периферической крови зараженных индивидуумов. Например, одноядерньте клетки из периферической крови, такие, как лимфоциты, могут быть получены путем наслоения пробы гепаринизированной венозной крови по градиенту плотности РйсоП-Нураопе и центрифугирования пробы. Одноядерные клетки затем собирают, активируют, таапршф, фитогемагглютинином, в течение двух-трех дней и культивируют в подходящей среде, предпочтительно попали пенной интерлейкином 2. Вирус может быть обнаружен либо анализом на обратную транскриптазу, анализом с захватом антигена для р 24, иммунофлюоресценцией, либо электронной микроскопией для обнаружения присутствия вирусных частиц в клетках. Все эти методы хорошо известны спеЦИдлистам в данной области. После выделения вирус может быть включен в другие клетки.Важно использовать неинфекционную вакцину с тем, чтобы избежать проникновения инфекции в хозяина Различные методы хорошо известны для придания болезнетворному организму неинфекционности. Вирус можно инактивировать или сделать репликационнонедостаточным. Предпочтительно, однако, обрабатывать его комбинацией бета-пропиолакто 10на и гамма-излучения, При этом Б-пропиолактон должен находиться в контакте с вирусом,как минимум, 2,5 часа. С тем, чтобы полностью удалить какой-либо остаточный бета-пропиолактон, бета-пропио- лактон должен оставаться в растворе в течение, как минимум,пяти часов при температуре 37 С.Выделенный вирус затем обрабатывают так,чтобы удалить белки наружной оболочки. Такое удаление предпочтительно осуществляют неоднократными замораживанием и оттаиванием вируса в сочетании с физическими методами, которые вызывают набухание и сокращение вирусных частиц, хотя также можно использовать другие физические и нефизические методы, такие, как разрушение ультразвуком, в отдельности или в сочетании друг с дРУгом.Для иммунизации человека или Животного получаемый предлагаемым способом штмуноген применяется, вместе со вспомогательными веществами. Но он может также применяться в своей водной форме без вспомогательного вещества. При этом дозу выбирают так, чтобы она была иммунологически эффективной, и она, как правило, составляет от 1 до 100 мкг белка, предпочтительно, около 30 мкг белка.Активную иммунизацию осуществляют н,предпочтительно, повторяют раз с ьшнимальным интервалом, по меньшей мере, 90 дней,хотя дополнительные ревакцинации могут подходить в соответствии с изменениями в уровне иммунной активности на основе, например,уменьшения количества антител против НИгенным продуктам, другим, нежели белки наружной оболочки. Такую иммунизацию предпочтительно осуществляют первоначально путем внутримышечной инъекции с последующей внутрикожной инъекцией, хотя может быть использована любая комбинация внутрикожной и внутримышечной инъекции.Предпочтительно, иммунокомпетентность или иммунную активность сероположительного индивидуума определяют перед шлмуьшзацией с тем, чтобы определить подходящий путь лечения. В качестве метода такого определения сыворотки пациентов подвергают скринишу на Присутствие антител против р 24(например, при помощи иммуноферментного твердофазного анализа), антитела против обратной транскрилтазы и/шш уровня клеток Т 4 при помощи хорошо известных методов. Пациенты, проявляющие индикаторы низкой иммунокомпетентности, например, низкие титры р 24 или антитела против обратной транскриптазы, или низкие количества клеток Т 4, являются подходящими кандидатами для пассивной иммунотерапии предпочтительно вСеронегативные индивидуумы могут быть вакпннированы с тем, чтобы вызвать иммунозашптные факторы для предотвращения инъекции. Предпочтительно, вакцину вводят первоначально путем внутримышечной инъекШш с последующим введением бустера, осуществляемым либо внутримышечно, либо внутрикожно. Физиологически эффективная доза содержит предпочтительно от 1 до 100 мкг. и более предпочтительно- около 30 мкг иммуногена. Вакцину предпочтительно вводят в сочетание с адъювантом, т.е. вспомогательныы веществом, наиболее предпочтительно, адъювантом для обеспечения получения препарата типа вода в масле. Различные подходящие адъюванты хорошо известны в данной области.Кроме того, поскольку антитела против 333160/ 120 могут содействовать вирусной абсорбции клетками, эти специфические антитела могут быть удалены из пациента,зараженного Н 1 У, перед иммунотерапией. Иммуносорбентньте колонки, вьшолненные из полых цегшюлозных волокон, модифицируют с тем. чтобы ковалентно связать Лиганды, реакционноспособные с антителами против др 160/ 120. Такие шианды включают антигены вр 160/ 120, полученные из очищенных гликопротеинов, которые в свою очередь получены из только что собранных вирусных частиц или из кулътуральното супернатанта НШ-продуцируюших Т 4-лимфоцитов. Альтернативно, такис литанды могут быть получены методами рекомбинантной ДНК с использованием трансфепнрованнътх клеток. Альтернативно, идиотипы, реакционноспособные с антителами против 3 р 1 бО/ 120, могут быть использованы для этих целей.Такие антиидиотипные антитела могут быть получены методами, хорошо известными в данной области.Изобретение иллюстрируется следующими примерами.Пример 1 П туч ви ных ч ти в н н й кКлетки, зараженные штаммом НП Но. НЕ 321 (выделившимся из плазмы 2 б-летней африканской женщины из Саира) выращивают в среде А, состоящей из КРМ 1 1640 с 10-ной эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота, 25 мм буфера НЕРЕЗ, 50 мкг/мл гентамипина и 100 мгк/ мл стрептомицина.КУЛЬТУРЫ увеличивают в объеме путем подачи исходных клеток в Центрифужные пробирки и доведения объема приблизительно до 8 л добавкой предварительно нагретой среды А. При этом степень разведения составляет приблизительно 15. Затем осуществляют второе разведение в соотношении 13.Супернатант от 5-7-дневной суспензии НИзараженных клеток фильтруют через фильтр размером 0,45 мкм. Свежеприготовленный раствор 140 бета-пропиолактона прибавляют к супернатанту до конечной концентрации 14 ОО 0. Раствор инкубируют в течение пяти часов при температуре 37 С, рН поддерживают на уровне 7,2-7,4.Через 5 часов 20 мл раствора супернатанта удаляют с тем, чтобы определить уровень инфективности и количество оставшеюся бетапропиолактона. Затем супернатант замораживают при температуре - 70 С. Замороженный супернатант затем подвергают гадала-облучению кобальтомбо мощностью 4,5 мВ.Раствор супернатанта затем оттаивают и концентрируют путем 40-кратной фильтрации через выполненные с молярной массой 100 000 фильтры. Концентрат подают в снабженные мешалкой колбы Т-21, предварительно обработанные 70-ным изопропанолом, и центрифугируют при 28000 об/ мин в течение одного часа. Супернатант удаляют и осадок повторно суспендируют в содержащем ЭТУК натриевом буфере до общего конечного объема приблизительно 24 мл. 4 мл этой суспензии расслаивают над 8 мл 30-ной сахарозы в полиалломерных пробирках, предварительно обработанных 70-ным изопропанолсм, и центрифугируют в течение одного часа при 28000 об/ мин. Супернатант сливают из 30 ной сахарозы и осадок ресуспендируют в указанном натриевом буфере.Градиент в ультрасветлых центрифужвгых пробирках, предварительно обработанных 70-ным изопропанолом, устанавливают путем прибавления 3 мл 45 -й сахарозы в пробирку и наложения сверху 6 мл 30-й сахарозы. З мл вышеописанной суспензии наслаивают на раствор. Пробирки центрифугируют в течение 60 минут при 28000 об/мвн.Раствор над слоями при 35-м переходе отсасывают пипеткой и сливают. Слои из всех пробирок соединяют в одной конической пробирке и разбавляют в соотношении 110 фосфатсодержащим буферным солевым раствором.пробирках, предварительно обработанных 7 О-ным изопропанолом, в течение одного часа при 28000 об/ мин. Супернатант удаляют и осадки в пробирках ресуспендируют в указанном фосфатсодержашем буферном растворе при концентрации 1 мл на 10 л исходного вещества.Альтернативно, особенно, когда иммуноген получают в больших количествах, стадию облучения можно осуществлять после объединения слоев. Затем вирус расслаивают на градиенте 15-50-й сахарозы. Вирусные слои объединяют и ресуспендируют в вышеуказан Ыном фосфатсодержашем буферном растворе. Вирус центрифугируют при 28000 об/ мин в течение одною часа п ресуспендируют в упомянутом буферном растворе до конечной концентрации, равной 1,0 мг/мл.Количество имеющегося белка определяют в соответствии с методом Бредфорда (Апа 1. Вйоспеш, 72, стр. 248. 1976).Белок разбавляют вышеуказанным фосфатсодержащим буферньш раствором до концептрации, равной 1,0 мг/ мл.Уровень остаточного бета-пропиолактона в иммуногене определяют с использованием капиллярного газожидкостного хроматографа. При этом приготовляют стандартные растворы бета-пропиолактона и масляной кислоты, имеющие концентрации между 1 и 500 частями на миллион. Пробы объемом 2 мкм вводят в капиллярный хроматограф в соответствии с рекомендацией изготовителя. Предел обнаружения составляет 0,1 ч/милл. ИммуногенВосемь проб иммуногена анализируют на содержание бета-пропиолактона капиллярной газовой хроматографией, используя масляную кислоту в качестве внутреннею стандарта. Используют следующие хроматографические условия колонка 30 м х 0,25 мм, кварцевое стекло, открытая, трубчатая стационарная фаза 100-ный цианопрошШ-кремний температура ввода пробы 140 С рабочая температура 70 С/1 мин 20 С/мин до 130 С методика ввода пробы нерасщешгяющая. При вышеприведенных условиях время удерживания бета-пропиолактона и масляной кислоты соответствует 7,52 мин и 6,70 мин, соответственно. Ввод 2 мкл 1 ч/милл. раствора бетапропиолактона приводит к получению пика,который может быть измерен количественно. Концентрация 1 ч/милл. раствора до 1/10 его объема упариванием растворителя при температуре 40 С при пониженном давлении не приводит к ощутимой потери бета-пропиолактона. Предел обнаружения после конЦеНТРНЦИИ СОставляет 0,1 ч/милл./0,1 мкг/мл.С тем, чтобы подтвердить то, что нммуноген свободен от белков наружной оболочки, иммуноген вначале разделяют на 11,0-ных полиакриламидных гелях с применением додецилсульфата натрия в соответствии со способом Лэммли (Матпге 227, стр. 680, 1970). Очищенный материал затем переносят на нитроцеллюлозную бумагу в соответствии с методом, предложенным Т аубином и др. (Ргос. Ыатпге. Асас 1. 5431., 76, стр. 4350, 1979), и иммуноокрашивают в соответствии с методом,предложенным Цанг и др. (Мент. Еп 2 уша 1 о 3 у,92, стр.377, 1983). Как можно видеть на фиг. 4, пятна полученного таким образом иммуно 5гена Не имеют полосу, соответствующую 3 р 120/1 б 0, как указано в контрольных испытаниях, при взаимодействии с сыворотками,содержащими высокие титры анти-5 р 1 б 0/ 120.Как показано на фиг. 4, коммерческие полоски с имеющимися на ник белками НП,подвергнутые скринингу с гетерологичной сывороткой ( шимпанзе А 86-С и А-З), и содержащие высокие титры антител против белков наружной оболочки, 5 р 160/ 120, являются негативвьши (нереакционноспособными) на полосках, полученных при анализе полученного вышеописанным образом иммуногена, свободного от наружной оболочки. Гомологические человеческие сыворотки (003 и 010), содержащие высоко-титры антител против белков наружной оболочки, 3 р 1 б 0/120, являются реакционноспособнъгми с Коммерческими полосками, но негативными с полосками, полученными из иммуногена, свободного от наружной оболочки. Как гомологические, так и гетерологические сыворотки вступают во взаимодействие с другими генньши продуктами НПДОтсутствие белков наружной оболочки на предлагаемом иммуногене подтверждают электронной микроскопией. К ггммуногенному препарату последовательно добавляют 2,5 -ный глутаральдегид и осмиевый ангидрид, дегидратируют с помощью растворов этанола разных концентраций и заливают в ЕРОЫ-812. Тонкие Шлифы получают с помощью прибора ЬКВ Мтсготоше (фирма ЬКВ, Уписала, Швеция) с использованием алмазною скальпеля. Толщина шлифов составляет 60 нм. Шлифы окрашивают уранилацетатом и лимоннокислым свинцом, наблюдают и фотографируют с использованием электронного микроскопа марки Цейс 109. Служащие в качестве контроля клетки, зараженные Н 1 У, подготовляют с использованием той же методики. При этом обнаруживают, что иммуноген не имеет темзло-окрашенную наружную оболочку, которая присуща контрольным пробам и которая отражает др 1 б 0/ 120 на вирусной поверхности.Девять пациентов, сероположительных к НШ, лечат иммунотерапией при даче иммуногена по примеру 1. При этом иммуноген эмульгирутот в соотношении 11 в неполном адъюванте Фройнда в эмульсификаторе марки Брех 8000 Мйхег МШ инофирмы Спекс Индастриз Инк., США. 1,0 мл раствора, содержащего 100 мкг белка, вводят внутримышечно. Бустер 100 мкг белка без адъюванта вводят через 90 дней путем внутрикожной инъекции.Присутствие вируса НП/ в лимфоцитах периферической крови пациентов определяют