Модифицированный 2′,3′-дидезоксиуридином фосфолипид, фармацевтическая композиция и противоядие к действию яда кобры

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Литвинко Наталья Михайловна Калиниченко Елена Николаевна Жерносек Елена Владимировна Кучуро Светлана Викторовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Модифицированный 2,3-дидезоксиуридином фосфолипид, полученный гидролизом природного фосфатидилхолина фосфолипазойс последующей конденсацией фосфатидовой кислоты с 2,3-дидезоксиуридином в присутствии 2,4,6-триизопропилсульфонилхлорида с использованием пиридина в качестве растворителя. 2. Фармацевтическая композиция для повышения устойчивости к действию фосфолипазы А 2 яда кобры, включающая модифицированный фосфолипид по п. 1. 3. Применение модифицированного фосфолипида по п. 1 в качестве противоядия к действию яда кобры. Изобретение относится к области биоорганической и фармацевтической химии, в частности к новым биологически активным веществам, а именно к 2,3-дидезоксиуридин содержащему конъюгату фосфолипида, его получению и фармацевтической композиции на его основе, проявляющей повышенную устойчивость к фосфолипазе А 2 (ФЛА 2) яда змеи. Существенные изменения уровня активности ФЛА 2, катализирующей гидролиз фосфолипидов по 2-му положению глицеринового скелета, наблюдаются при остром панкреатите, воспалительных процессах, патогенетических поражениях печени, гипоксии,аллергии и тромбообразовании, отеках вследствие радиационного поражения и развитии злокачественных новообразований. Накопление продуктов ферментативного гидролиза 11904 1 2009.06.30 фосфолипидов в органах и тканях является признаком ишемической болезни и следствием активации ФЛА 2. Клеточные ФЛА 2 играют ключевую роль в биосинтезе активных метаболитов арахидоновой кислоты. Воздействие ядов змей на организм млекопитающих также связано с функционированием ФЛА 2. Известны биологически активные 3-ацил-2,4-тиофендионы (2-4), проявляющие противоартритные 1, иммуносупрессорные 2, антибактериальные свойства 3, являющиеся структурно родственными природным антибиотикам тиолактомицину (5 а) и тиотетромицину (5 б), выделенным из почвенных бактерий рода 4. Известны 2,галоген,алкил или алкокси 3,галоген, алкил, алкокси 4,Н, , , ,1-15,0-20 также соединения (4), имеющие достаточно объемную гидрофобную боковую цепь, которые ингибируют фосфолипазу А 2 (ФЛА 2, К.Ф. 3.1.1.4) форменных элементов крови и синовиальной жидкости 3. Описанные вещества (2-4) рассматриваются как полезные только при лечении расстройств, вызываемых продуктами окисления арахидоновой кислоты, которая высвобождается из фосфолипидов под действием внутриклеточной высокомолекулярной (80 кДа и выше) ФЛА 2, содержащейся в форменных элементах крови. Соответственно, указанные соединения могут быть полезны только для предотвращения и лечения иммуновоспалительных заболеваний, таких заболеваний как аллергия, анафилаксия и воспаление, вызванное только оксилипинами (продуктами окисления арахидоновой кислоты). В круг таких заболеваний входят аллергические риниты, аллергическая бронхиальная астма,бронхиальные обструктивные расстройства верхних дыхательных путей, а также различных прямых гиперчувствительных реакций, таких как аллергический конъюктивит, воспалительные процессы, имеющие место при ревматоидных артритах, остеоартритах,тенденитах, бурситах, псориазе и др. Суперсемейство липолитических ферментов фосфолипаз А 2 объединяет 11 классификационных групп 5, которые делятся на два больших пула. Один пул представляют низкомолекулярные (12-18 кДа) внеклеточные ферменты, выделяемые железами внутренней секреции млекопитающих (поджелудочная железа, семенники, селезенка, тимус) и ядовитыми железами змей, у которых установлено участие аминокислоты гистидин в каталитическом акте. Второй пул представляют высокомолекулярные (80 кДа и выше) внутриклеточные ферменты, у которых установлено участие в каталитическом акте другой аминокислоты - серин. Таким образом, указанные выше соединения 1-5 а,б имеют ограниченный спектр действия, распространяющийся только на группы фосфолипаз,входящих во второй пул этого суперсемейства. В то же время известно, что нервнопаралитическое и гемолитическое действие яда змей также связано с активностью низкомолекулярной формы ФЛА 2 6. Липосомальное наноструктурное инкапсулирование лекарственных средств для лечения ряда заболеваний интенсивно исследуется в настоящее время 7. В результате взаимодействия различных белков с заряженной поверхностью фосфолипидов при прохождении липосом к органу-мишени через биологическое пространство возможно изменение устойчивости липидной капсулы к действию липолитических ферментов, в частности для фосфолипазы А 2 8. Конъюгаты фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот, которые имеют фосфолипидный якорь, необходимый для образования липосо 2 11904 1 2009.06.30 мальных контейнеров, представляют особый интерес для доставки нуклеотидов с антифосфолипазными свойствами к пораженным змеиным ядом органам и последующего внедрения в клеточную мембрану. Известны биологически активные конъюгаты фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот 9-13. Описаны способы получения конъюгатов фосфолипидов с модифицированными компонентами нуклеиновых кислот на основе фосфатидовой кислоты 10, 11, 13, диацилглицерина 11 или моно- и диалкилглицерина 11, 12. Для фосфатидилнуклеозидов диалкильного типа 11 описан Н-фосфонатный 3-х стадийный метод, состоящий в реакции 1,2-дигексадецилглицерина с треххлористым фосфором, последующей конденсацией с 3-азидо-3-дезокситимидином и 2,3 дидезоксиинозином в присутствии пивалоил хлорида с образованием фосфитдиэфиров,которые окисляются действием йода в пиридине до конечных продуктов. Известен также способ получения нуклеозидсодержащих производных фосфатидилхолина, модифицированных по холиновому фрагменту 11, который осуществляется в две стадии. На первой стадии проводится ферментолиз яичного фосфатидилхолина фосфолипазой . На второй стадии полученная фосфатидовая кислота конденсируется с 3 азидо-3-дезокситимидином в присутствии -толуолсульфохлорида с образованием фосфатидатов 3-азидо-3-дезокситимидина диацильного типа (прототип). Однако, известные соединения не охарактеризованы на устойчивость к деградации под действием ФЛА 2, что не позволяет создать на их основе устойчивые к действию низкомолекулярных секреторной ФЛА 2 яда фармацевтические композиции. Задачей настоящего изобретения является новый модифицированный 2,3 дидезоксиуридином, проявляющим противовирусное действие, фосфолипид, фармацевтическая композиция на его основе, обладающая повышенной устойчивостью к действию фосфолипазы 2 кобры, а также применение заявленного соединения в качестве противоядия к действию яда кобры. Поставленная задача решается заявляемыми соединениями общей формулы ,1, 2 - алкильный остаток жирной кислоты. Указанное соединение представляет собой объединенные в единой молекуле модифицированный компонент нуклеиновой кислоты и липидную составляющую, что обусловливает их пониженную чувствительность по отношению к активности низкомолекулярных секреторных фосфолипаз А 2. Заявленное соединение представляет собой новую 11904 1 2009.06.30 липосомальную форму 2,3-дидезоксиуридина, обладающего противовирусным действием, устойчивую к действию секреторной фосфолипазы А 2. Еще одним объектом настоящего изобретения является получение заявляемых соединений, заключающееся в конденсации фосфатидовой кислоты 2, полученной из природного фосфолипида с помощью фосфолипазы ,2 с 2,3-дидезоксиуридином, в присутствии триизопропилсульфонил хлорида . В предпочтительном варианте осуществления заявляемого способа процесс ведут в пиридине с промежуточным высушиванием конденсируемых веществ при температуре до 50 С с использованием 2,4,6-триизопропилсульфонил хлорида в течение не менее 28 час и последующей очисткой на колонке с силикагелем. Способ иллюстрируется нижеприведенной схемой. а-2,3 -дидезоксиуридил,1, 2 - алкильный остаток жирной кислоты. Выходы целевых продуктов (1 а) после хроматографического деления на силикагеле составляют 60 . Заявляемый способ позволяет легко вводить разнообразные нуклеозидные заместители в полярную часть молекулы фосфолипида и, тем самым, упростить получение конъюгатов природных фосфолипидов с компонентами нуклеиновых кислот. 11904 1 2009.06.30 Следующим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, включающая модифицированный 2,3-дидезоксиуридином фосфолипид, для повышения устойчивости к действию ФЛА 2 яда кобры. Заявляемая композиция представляет собой новую липосомальную форму 2,3-дидезоксиуридина, проявляющего противовирусное действие, устойчивую к действию ФЛА 2 яда кобры. Кроме действующего начала композиция включает любые фармацевтически приемлемые носители, наполнители и т.п. Применение заявляемого соединения в качестве противоядия обусловлено возможностью доставки нуклеотидов с антифосфолипазными свойствами к пораженным змеиным ядом органам с последующим внедрением в клеточную мембрану. Приведенный ниже пример получения заявляемого соединения подтверждает возможность осуществления изобретения, не ограничивая его объем. Пример 1 Конденсация 2,3-дидезоксиуридина (а) с фосфатидовой кислотой. Фосфатидовую кислоту получают гидролизом природного фосфатидилхолина под действием фосфолипазы 15. 2,3-Дидезоксиуридин (а) синтезируют дезаминированием 2,3-дидезоксицитидина нитритом натрия в водной уксусной кислоте. Фосфатидовую кислоту (40 мг, 0,062 ммоль) и 2,3-дидезоксиуридин (10 мг, 0,047 ммоль) дважды растворяют в 1 мл пиридина, выпаривают, высушивают при нагревании до 50 С на вакуумном насосе. Остаток растворяют в 1 мл пиридина, добавляют 40 мг (1,32 ммоль) 2,4,6-триизопропилсульфонил хлорида. Реакционную смесь перемешивают в течение 28 часов на магнитной мешалке при комнатной температуре, затем добавляют 1 мл воды, выдерживают в течение 20 минут, выпаривают. Остаток наносят на колонку с силикагелем и элюируют смесью хлороформ-метанол. Получено 8 мг 2,3-дидезоксиуридин 1,2-диацилглицеро-3-фосфо)-уридина 1 а (20 ). Структура химерного соединения 1 а, подтверждена (таблица 1) совокупностью физико-химических данных (УФ, ПМР, ЯМР Р 31). Таблица 1 Физико-химическая характеристика соединения 1 а Шифр Название Характеристика 2,3-дидезокси- ТСХ,0,58 (хлороформметанолвода - 1061), УФ 1 а 5-(1,2-диацил(хлороформметанол, 23),нм 262 (8400).(уш.с., 1 Н, Н-5), 5.95 уш.с., 1 Н, 1-Н), 7.86 (уш.с., 1, Н-6). Биологическое действие заявляемого соединения подтверждено тестированиемс использованием ФЛА 2 яда кобры, результаты которого приведены в разделе Исследование биологической активности. Исследование биологической активности При проведении реакции липолиза максимальная доступность субстрата для фермента обеспечивается в случае использования фосфолипидов в мицеллярной фазе, сформированной детергентами, которые рассматриваются как неизменная матрица, поскольку не гидролизуются фосфолипазами 6. В связи с этим для определения устойчивости синтезированных химерных субстратов к атаке ФЛА 2 используют мицеллярную фазу, сформированную конъюгатами и детергентами. Смешанные мицеллы получают солюбилизацией раствором детергента пленки, образующейся после удаления растворителя из раствора фосфатидилэтаноламина, ФЭА (или конъюгата) в хлороформе. Смешанные мицеллы готовят включением ФЭА (или конъюгата) в фазу поверхностно-активного вещества - тритона-Х-100 (ТХ, неионный детергент 5 11904 1 2009.06.30 при оптимальном соотношении 18). Диметилсульфоксид (ДМСО) добавляют к 0,05 М трис-НС, рН 7,4 - 110 соответственно. Соединение 1 а вносят в виде раствора в хлороформе и упаривают. Реакционная смесь содержит субстрат (0,51 мкмоль), 2 мМ СаС 2 и 0,05 М трис-, рН 7,4. Реакцию гидролиза смешанных мицелл фосфолипида или конъюгата 1 а начинают добавлением в среду при 37 С раствора ФЛА 2 яда змеи (0,066 ед./мл) и останавливают добавлением ЭДТА до конечной концентрации 15 мМ, упаривали пробу при 40 С. Продукты реакции анализируют с помощью тонкослойной хроматографии на силикагеле в системе растворителей хлороформ/метанол/вода 1061. Пластины проявляют реагентом на фосфолипиды 16,пятна фосфолипида, конъюгата и их лизопроизводных выскребают и анализируют в них содержание фосфора по методу, описанному в работе 16. За единицу активности фермента принимают количество ФЛА 2 яда змеи, катализирующее образование 1 мкмоль продукта / мин 37 С. На основе изменения скорости гидролиза ФЭА или конъюгата 1 (а) (, мкмольмин-1 мг-1) в мицеллярной фазе под действием ФЛА 2 обнаружено, что на всем временном интервале скорость гидролиза конъюгатов 1 а по сравнению с ФЭА была существенно ниже за три часа ФЛА 2 яда змеи гидролизует 80 ФЭА, 362,3-дидезокси-5-О-(1,2-диацил-глицеро-3-фосфо)уридина (1 а), скорость гидролиза (мкмольмин-1 мг-1) составила соответственно 0,11, и 0,05 (таблица 2). Таким образом, модифицированный субстрат разрушается ферментом вдвое с более низкой скоростью, чем природный фосфолипид. Таблица 2 Гидролиз под действием ФЛА 2 яда змеи фосфатидилэтаноламина и конъюгата 1 а Субстрат Источники информации 1.. . . . . (С). 1968, 1501. 2.К.,. . . 1983, 36, 1589. 3. Патент США 5366993, .15 7 333/16 61 31/38. ,С, , ,заявки 71627. Заявл. 03.06.1993. 4.Т.,.,.,.,. . . 1982, 35, 401. 5. , ,, (2000) . . , 1006, 1-9. 6. Литвинко Н. М. Активность фосфолипаз А 2 и С при биохимическом моделировании. - Мн., 2002. 7. Грегориадис Г. Липосомы в биологических системах. - М. Медицина, 1983. - С. 3693. 8. Литвинко Н.М., Шумилина Т.А., Наубатова М.К., Ахрем А.А. Изучение устойчивости липосом как потенциальных переносчиков лекарственных веществ к действию фосфолипазы А 2 // Прикладная биохимия и микробиология. - 1993. - Т. 29, вып 3. - С. 478-484. 9..,,Т. Т.. -3.11 51,2 151,2- // - 1982. - .25. - . 1322-1329. 10. Водовозова Е.Л., Павлова Ю.Б., Полушкина М.А., Ржанинова А.А., Гараев М.М.,Молотковский Юл.Г. Новые фосфолипиды - ингибиторы репродукции вируса иммуноде 6- С. 451-457 (прототип). 11..,.,.,Т.,.92-// - 1999. - 7. - . 1195-1200. 12. Фещенко Л.Л, Барай В.Н., Кисель М.А., Зинченко А.И., Михайлопуло И.А. Субстратные свойства модифицированных нуклеозидов в реакции трансфосфатидилирования,катализируемой фосфолипазойМатериалы межд. конференции Микробиология и биотехнологиястолетия / НАН Беларуси, Ин-т микробиологии НАНБ, концерн Белбиофарм. - Минск, 2002. - С. 106-108. 13. Патент 2254133 С 2 2 254 133 А 61 К 31/513, 45/06, А 61 3 31/18 , , .,,.,заявки 2001 123432/15. Заявл. 21.01.2000. 14. , . .// - 1961. - . 83. - . 649-659. 15. Бергельсон Л.Д., Дятловицкая Э.В., Молотковский Ю.Г. и др. Препаративная биохимия липидов. - М., 1981. 16.,, // . - 1975. - .114.1. - . 129-141. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7