Способ разделения белков крови

Так, например, при лечении гемофилии А важно иметь концентраты фактора УШ очень высокой степени очистки. В этих случаях больные получают многократно повторные инъекции концентратов факторов УШ и,одновременно, большие количества фибриногена и иммуноглобулинов, которые могут вызывать нежелательные иммунные реакции. В связи с этим повторные инъекции недостаточно очищенного фактора УШ можно производить только используя концентраты плазмы лишь одной группы крови, во избежание типичных при переливании крови осложнений,обусловленных различными группами крови или присутствием иммуноглобулинов.Концентраты фактора УШ наиболее часто получают из.плазмы человеческой крови методом криопреципитации. Степень очистки концентратов фактора УШ, обычно получаемых в коммерческих масштабах центрами по переработке человеческой крови, часто лежит в пределах 1 международной единицы/мг и обычно не превышает 10-20 международных единиц/ мг. Общепринятая технология получения использует процедуры осаждения, имеющие целью удаление нередко очень некачественное, таких белковых примесей, как фибриноген, фибронектин и иммуноглобулипы. Для этой цели применяются преципитация при низкой температуре (10) или ее комбинация с такими осаждающими белками агентами, как гидрофильные полимеры,напрнмер,ПЭГ (ВгХ. Наешато, 21, 1-20,1971,1 ТМетЬос 1 з оЕ ршзша-рготейп йасйопайоп,Асааешйс ргезз, 1980, 57-74), поливиншпшрролидон (Вг. У. Наешато 1, 50, 665-6723982), декстран, фикол, перкол, оксиэтилировавный крахмал или альбумин. Они были, в частности,предложены для осаждения фактора УШ(ТигошЬ. Наешозтаз, 51, 338-342, 1984). То же относится к глицину и хлористому натршо,применение которых предложено Гореллдом и Бембеком. Некоторые авторы (ТпгошЬозш Нее, 42, 825-834, 1986) получили хорошиерезультаты, применяя СОЧСТЗНИЕ трех СОВДИ-Унений, например, ПЭГ, глицина и хлористого натрия, что давало концентраты фактора УШ со специфической активностью от 10 до 16 МСЖДУНЗРОДНЫХ ЕДИНИЦ МГ.С Целью получения фракции высокомолекулярного материала, содержащей фактор УШ С в комбинации с фактором фон Виллебранда(комплекс, частично очищенный от фибриногена), предлагалось использовать стерео-селективнуто хроматографию шш гешгфшгьтрашпо. Эти методики позволяют получать, хотя и с небольшим выходом, продукт, специфическая активность которого не превышает 30 международных единиц/мг и для стабишазации которого требуется добавление альбумина (чтоприводит к уменьшению специфической активности примерно до 3-5 международных единиц/мг). При таком подходе возникают трудности, связанные с адаптацией методики к условиям крупномасштабного производства и необходимостью поддержания высокой разрешающей способности промышленных гельфильтрационных колонок на протяжении известного периода.Концентраты фактора УШ получают также посредством включения в технологическую схему стадии адсорбции на микрогранулах пористого силикон-диоконда с целью очистки от низкомолекулярных белковых примесей (Чох 5 ап 3,341-348,1984). Специфическая активность продукта при этом относительно невелика (1 международная единица/мг).В последнее время появились новые методы получения высокоочищенных концентратов фактора УШ. Так, например, компании Хиланд и Травенол предложили способ получения концентратов с помощью иммуноафинной хроматографии (Тпгошьозйз Ке 5. 5 црр 1. УП,р.58, 1987 Тпгошъозгз Все, 5 ирр 1. Ч 1 П,р.60,1987 Т 11 гошЬоз 15 Еез, БЦррЦ/П), В соответствии с этим методом фактор УШ очищают на антителах к фактору УШС или фактору фон Виллебранда, иммобилизованных на хроматографической среде. Этот способ дает хорошие результаты, но требует применения высокоактивных растворителей на стадии десорбции фактора УШ со специфических антител или с антител к фактору фон Виллебранда. В связи с этим необходима дополнительная процедура ультрафильтрации, с помощью которой удаляются нежелательные химические агенты, что может отрицательно сказываться на биологической активности фактора УШ.Специфическая активность этого фактора в процессе производства может достигать 1000 международных единиц мг и даже 3000 международных единиц / мг, однако его нестабильность заставляет применять стабилизаторы,например альбумин, на стадии, предшествуюЩей лиофильной сушке, что вызывает снижение специфической активности до 3-5 международных единиц мг. Тем не менее, основным недостатком методики получения фактора УШ методом иммунного сродства является присутствие в препарате остаточных антител. Поскольку последние получают иммунизацией мышей, они могут вызывать у больных иммунные реакции, как при введении любых инородных для организма белков.Использовалась также Ионообменная хроматография, однако, сфера ее применения ограничивается лабораторными экспериментами в связи с технической сложностью этой методики и низким выходом конечного продукта.В работе Дж.Дж. Моргенталпера (ТпгошЬ. Наешовтаз, Зтитгагт, 47 /2/ 124-127, 1982) обсуждается, например, способ очистки фактора УШС с использованием хроматографии полиэтиленгликольного прецппитата на модифицированной сефарозе. Однако, указания на показатели выхода продукта и воспроизводимость результатов при использовании различных подходов отсутствуют.Таким образом, представляется совершенно необходимой разработка новых методов получения (больших) белковых концентратов, в частности фактора УШ, которые можно было бы внедрить в промышленное производство с целью достижения высокого выхода продукта,полностью свободных от посторонних белков,таких как антитела животного происхождения.Заявитель предлагает процесс очистки на основе анионообменной хроматографии, который позволяет, благодаря правильному подбору смолы, отделять искомый белок на одной хроматографической колонне при условиях, устраняющих необходимость последующей обработки, например, УЛЬТРЗФИЛЬТРЗЦИЯ- ЭТО предотвращает усложнение процесса и снижение специфической активности очищенного белка.Таким образом, изобретение относится к процессу очистки белков плазмы крови, конкретно - фактора УШ, фибриногена, фибронектина и фактора фон Виллебранда,отличающегося тем, что солюбилизированная фракция криопреципитата плазмы человека подвергается хроматографии на анионообменной смоле относительно умеренной ионной силы, обеспечивающей гидрофобные взаимодействия, но не адсорбирующей определенные белки, фиксированные на смоле белки специфически элюируются при увеличении ионной силы буферного раствора.Этот процесс пригоден также для работы с плазмой крови животных, например, свиней,что необходимо в некоторых случаях гемофилии у больных, сыворотки которых обладают ингибирующими свойствами и для лечения которых нельзя использовать человеческий фактор УШ.В качестве исходной фракции МОЖНО ИСПОЛЬзовать фракцию криопреципитата плазмы, в том числе подвергавшуюся предварительной обработке перед процедурой очистки. Такая обработка может заключаться, например, в осаждений окисью алюминия и/или в низкотемпературной преципитации обычными методами, применяемыми для обработки таких фракций.При тестировании различных смол на эффективность хроматографического разделения установлено, что наилучшие результатыДЭАЭ - группировки, фиксированные на виНил-полимерном геле, например, фрактогеле ТСК. Смола такого типа поступает на рынок под названием фрахтогель ТСК - ДЭАЭ 650/М/ (фирма Мерк). Основанная на ней хроматографическая система дает намного лучшие результаты, чем системы на основе других типов гелей, таких как ДЭАЭ - сефароза ЦЛ 6 Б, ДЭАЭ - сефароза ЦЛ - бБ (Разт -Б 1 ош) фирмы Фармация, ДЭАЭ сефароза 4 Б или ДЭАЭ - трисакрил ЛС фирмы ИБФ. Применение геля, подобного фрактогелю ТСК-ДЭАЭ (М), описано Като с соавторами(У. Спгошатон, 245, 1982, 193-211), которые рекомендуют его в качестве системы со средней эффективностью для коммерческого раз деления белков очень крупного размера.Особенности задержки и элюции материала на таком геле определяются его крупнопористой структурой и пониженной ионообменной способностью.Заявитель установил, что такой тип геля обеспечивает возможность преимущественной адсорбции крупноразмерных комплексов, образующихся при взаимодействии фактора УШ и фактора фон Виллебранда. Кроме того, посредством подбора соответствующих уравновешивающих и элюирующих буферных растворов, заявитель показал возможность использования слабогидрофобных связей, образующихся в результате длительной задержки крупноразмерных комплексов на поливинильном геле. Эти преимущества описываемого геля ранее не отмечались.Используя такую смолу для работы с фракцией плазмы, содержащей фактор УШ, например, предварительио очищенный раствор криопреципитата, а также соответствующие буферные растворы, получают концентрат фактора УШ очень высокой степени очистки с характеристиками, свойственными концентрату плазмы одной группы крови. Содержание фактора УШ в таких препаратах составляет 50 международных единиц/ мл при специфической активности свыше 200 международных единиц/мг, они не требуют ультрафильтрации, характеризуются высокой стабильностью И ПОЗВОЛЯЮТ ОТКЕЗВТЬСЯ ОТ ДОБВВЛСНРЪН СТабИ лизаторов белковой природы. С помощью той же хроматографической системы можно также получать фракции, обогащенные фибриногеном, фибронектином или фактором фон Виллебранда, с физико-химическими свойствами,удовлетворяющими требованиям клинического применения или использования в качестве реагентов. Кроме того, фибриноген может быть подвергнут дальнейшему концентрированию ДЛЯ ИСПОЛЬЗОБЗНИЯ В КЭЧЕСТВЕ бИВЛОГИЧЕСКОГОклея, в соответствии с заявкой на Европейский патент М 884019613Способ осуществляется следующим образом.Предварительно очищенную фракцию плазмы крови, содержащую основные белки криопреципитата, т.е. фибриноген, фактор УШ,фибронектин и фактор фон Виллебранда, пропускают ЧЕРЕЗ ВЫШЕОПИСЕННУЮ ЗНИОНООБМВН ную смолу. Фактор УЧИ, фактор фон Виллебранда и фибронектин (первые два фактора полностью или большая их часть, в зависимости от количества исходного материала) адсорбируются на смоле, тогда как фибриноген обнаруживают в фильтрате неадсорбируемых белков.При первом повышении ионной силы буферного раствора элюируются фибронектив и значителгьнаяьчаств факторалфожвиллебранда.Дополнительное увеличение ионной силы буфера приводит к элюции фактора УШ вместе с небольшим количеством фактора фон Виллебранда. Эту фракцию можно сразу подвергать лиофильной сушке, не добавляя в Нее стабилизаторы и не подвергая ультрафильтраЦИК.Наилучшие результаты дает использование БУФСРНОГО раствора, СОДРЖЗЩВГО ЛИЗИН В КОН центрациях от 2 до 4 г/л или глицин в концентрациях от 8 до 11 г/ л. Применение дРУГИх аминокислот или только одной из двух указанных аминокислот дает значительно менее эффективные результаты.Ионную силу буфера повышают добавлением хлористого натрия. Применение вышеуказанной смолы, характеризующейся умеренной ионной силой и слабой пщрофобностью, дает возможность использовать эту соль для десорбции фактора фон Виллебранда раньше фактора УШ и позволяет отказаться от хлористого кальция, который приходится впоследствии УЦЕЛЕТЬ ультрафильтрацией ДЛЯ ДИССОЦИЗЦИИ факторов УШ и фон Вшшебранда.Обработка с целью инактивации вирусов одним из существующих методов может, разумеется, производиться на любой стадиипроцесса. При использовании химического антивирусного средства инактивацию лучше всего проводить до нанесения проб плазмы на смолу. В. этом случае Хроматографический процесс обеспечивает эффективное удаление инактивирующих соединений.Хорошие результаты получены при испольЗОБННИИ РЕСТВОРОВ детергентов ДЛЯ ИНЗКТЙВБ. ции вирусов, как описано в Европейской патентной заявке Не 0131740.Фактор УШ может быть получен посредством хроматографии любой содержащей ЕГО бСЛКОВОЙ фракции, например, ИЗ предварительно очищенного криопреципитата плазмы, наносившейся на окись алюминия с последующим осаждением при низкой температуре, в соответствии с общеприня 10ТЫМИ способами ИЗГОТОВЛЕНИЯ КОНЦСНТРЗТОВ факторов УШ, как описано в Европейской патентной заявке Не 861042976.Специфическая активность фактора УШ С в исходной фракции может быть очень низкой(порядка 0,1 международной единицы/ мг). Оиостадийная анионообменная хроматография согласно данному способу обеспечивает его 40 О-700-кратную очистку. При этом выход составляет 75-90.Полученный таким образом концентрат фактора УШ характеризуется очень высокой степенью очистки при специфической активности более 100 международных единиц/ мг белка. Препарат не содержит фибриноген или иммуноглобулШГГ и в значительной степени свободен от фиброиектина. В нем отсутствуют такие антитела к факторам группы крови или их содержание незначительно. В связи с этим СГО МОЖНО КЛЗССИФИЦИРОВЗТЬ, В СООТВЕТСТВИИ с рекомендациями Европейской Фармакопеи,как концентрат плазмы крови одной группы даже в случае использования в качестве исходного материала плазмы, отбиравшейся без учета группы крови. Благодаря этому, препарат МОЖЕТ С УСПЕХОМ ПРИМЕНЯТЬСЯ В КЛИНИКЕ,особенно для лечения гемофилии А, когда требуются многохратшяе инъекции. Его можно использовать также в качестве реактива при любых тестах и анализах, требующих высокой степени очистки фактора УШ.Получаемые с той же хроматографической колонны другие фракции также представляют интерес с точки зрения своего белкового состава с одной стороны, они содержат фибриноген, который выделяют из первого фильтрата, а с другой стороны, фибронектин и фактор фон Виллебранда, которые элюируются после первою повышения ионной силы буферного раствора.Способ иллюстрируется следующими примерами, которые не исчерпывают возможности его применения.В качестве исходного материала используют криопреципитат плазмы человеческой крови,ресуспендированиый в водном растворе натронного гепарина (2 ед/мл) и содержащий фактор УШ со специфической активностью от 0,6 до 1,1 международных единиц/мг.рН суспензии доводят до 7,0-7,1 добавлением 0,1 М уксусной кислоты.Полученную таким образом суспензию криОЦРВЦИПИТЗТЗ подвергают ОЧИСТКЕ на геле ИЗ окиси алюминия и осаждением при низкой температуре. Окись алюминия добавляют в суспензию из расчета 108 г 2 ной А 1(ОН)з на кг криопреципитата при комнатной темпе 9 В 894 С 1 10ратуре И НЕПРЕРЫВНОМ ПОМВШИВННИИ В ТЕЧЕние 5 мин. рН доводят 0,1 м уксусной кислотой до 6,5 б,6. Затем суспензию охлаждают до 14-16 С, продолжают перемешивание. По достижении указанной температуры производят центрифугирование, на досадочную фракцию собирают и подвергают стерилизации посредством фильтрования.Такой предварительно очищенный раствор обрабатывают детергентом с целью инактивации вирусов, в присутствии твина ТНБП, в соответствии с описанием, приведенным в Европейской заявке на патент На 0131740.Б. Хроматографическое разделение на фрактогеле ДЭАЭ-ТСК.Из франт-отеля ТСК ДЭАЭ 650 (М) фирмы Мерктотовят хроматографическую колонку из расчета 0,5 л фрактогеля на кг криопреципитата. Колонну промывают 5 объемами 0,1 М раствора хлористого натрия и уравновешивают буферным раствором следующего составаНа КОЛОНКУ НЗНОСЯТ предварительно ОЧИЩЕНный, как описано в примере А, раствор криопреципитата.Получаемые фильтраты и элюаты анализируются на содержание белка по поглощению при 280 нм, которое в дальнейшем изложеНПН выражается В СДИНИЦаХ ОПТПЧЕСКОЙ ПЛОТ ности (О.П.)Первый фильтрат показывает пик белкового материала, не адсорбирующийся на коЛОНКС И СОСТОЯЩИЙ В ОСНОВНОМ ИЗ фибриногена (см. пример З).После прохождения этого пика, когда О.П. уменьшается до базальной величины, элюцию продолжают, используя тот же буфер, но более высокой ионной силы, которая достигается добавлением хлористого натрия до конечной концентрации 0,15 М. Этот буфер вызывает десорбцию белкового пика, содержащего основное количество фактора фон Вшшебравда и фибронектина (см. пример 4).После снятия этого пика и снижения О.П. до базального уровня повторно увегшчивают ионную силу буферного раствора, добавляя хлористый натрий до конечной концентрации 0,25 М.При этих условиях фактор УШ элюируется в концентрации порядка 30-40 международных единиц/ мл. аПолучение концентрата фактора УШ.Раствор фактора УШ, получешгьгй с помощью хроматографической процедуры, описанной в примере 1, характеризуется достаточно высокиМИ СТЕПЕНЬЮ ОЧИСТКИ И КОНЦСНТРВЦИВЙ, ЧТО позволяет сразу реализовать его по флаконам без дополнительной ультрафильтрации.При необходимости можно получать растворы различной концентрации, используя для Разведения тот же буфер, который использовали для элюции. Таким образом можно получать упаковки препарата со специфической активностью, соответствующей действующим стандартам. Усредненный состав получаемых растворов представлен нижефактора УШ С (междуна родные единицы /мг) сс-120-250 фибриноген (г/ л) менее /0,1/ фактор фон Виллебранда (Аз, ед. / мл) 11-23 фактор фон Виллебранда (КСО, ед. /мл) 10-20 фактор УШ (Ас, ед. / мл) 35-60 иммуноглобулины Г,мг/ мл (нефалометрия) менее 0,011 ПРИРОДНЗЫС И ИНДУЦИРОБЗННЫС анти - А - антитела 0-2 фибронектин (мг/л) 15-40.После лиофилизации получают чистый, быстрорастворимый продукт. Содержание фактора УШ С остается постоянным на протяжении суток при комнатной температуре.При инъекции людям обнаружение фактора УШ С сопоставимо с таковым при использовании менее очищенных продуктов. Сходным образом, период полужизни высокоочищенного фактора УШ сравним с тем же показателем у других препаратов.Показана высокая терапевтическая эффективность концентрата, особенно в случае повторных инъекций при лечении больных с гемофилией А. АПервый фильтрат, получаемый при хроматографии на колонке из фрактогеля ДЭАЭ,как описано в примере 1, содержит фибрино ген, а также альбумин, иммуноглобулины ифибриногена производят дополнительной хро матографией на колонке из гепарин-сефарозы.