Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)(72) Авторы Дрожденюк Анатолий Павлович Свиридов Олег Васильевич Вашкевич Ирина Игнатьевна ЧаЩин Вадим Леонидович Эпштейн Татьяна Викторовна Макаренко Михаил Васильевич Коломиец Эмилия Ивановна Здор Наталья Анатольевна (ВУ)(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси (ВУ)1) удаление из культуральной жидкости клеток Зггергошусез ауййпйй части примесных белков и пигментов соосаждением их с нерастворимыми солями металлов, в частности,путем растворения в культуральной жидкости соли фторида натрия до концентрации примерно 0,13 М и добавления эквивалентного количества раствора хлорида кальция и отделением осадка центрифугированием2) осаждение стрептавидина из полученного супернатанта растворимыми сульфатами,в частности сульфатом аммония, с последующим вь 1 держиванием в течение 3-4 часов на холоду при перемешивании и отделением стрептавидина центрифугированием3) очистку полученного стрептавидина путем его растворения в дистиллированной воде,центрифугирования, добавления К супернатанту холодного органического растворителя, в частности охлажденного до -18. . .-20 С изопропилового спирта, отделения осадка центрифугированием, его растворения в дистиллированной воде и центрифугирования с получением водного раствора целевого продукта стрептавидина.Изобретение относится К области биохимии и биотехнологии, а именно К способу вь 1 деления и очистки стрептавидина - одного из представителей группы специфических биотинсвязь 1 вающих белков.Стрептавидин образует чрезвычайно прочный комплекс (Ка 1015 М 1) с биотином(витамин Н), что позволяет специфически связывать биотинилированные белки, нуклеиновые кислоты и другие биополимеры с производными стрептавидина и использовать полученные растворимые или твердофазные комплексы в различных областях медицинской диагностики и прикладной молекулярной биологии, таких как иммуноанализ, выявление и изучение вирусных и наследственных заболеваний человека.Основным источником получения стрептавидина служит культуральная жидкость клеток Зггергошусез ауйбйпйй, которая помимо стрептавидина, содержит растворимые продукты жизнедеятельности бактерий и компоненты питательной среды, в том числе большие количества посторонних белков (97-98 ).Наиболее эффективный из существующих методов выделения и очистки стрептавидина 1 состоит в следующем. Стрептавидин в составе культуральной жидкости концентрируют ультрафильтрацией или осаждением сульфатом с последующим диализом раствора против дистиллированной воды. Дальнейшая очистка полученного таким образом препарата осуществляется с помощью двух аффинных хроматографий последовательно на биотин-сефарозе и на иминобиотин-сефарозе. Данный подход характеризуется наиболее высоким выходом стрептавидина из культуры клеток (-72 ) 1. Суть метода заключается в следующем.Частично очищенный стрептавидин получают высаливанием (1 ТН 4)25 О 4. Культуральную жидкость (2 л) центрифугируют 15 мин при 10000 5 для удаления клеток. К супернатанту порциями при перемешивании прибавляют твердый (1 ТН 4)25 О 4 до 70 насыщения и продолжают перемешивать суспензию 2 ч при комнатной температуре. Затем проводят центрифугирование на холоду при 10000 5 в течение 30 мин. Осадок растворяют в 100 мл дистиллированной воды, полученный раствор осветляют центрифугированием ( 10000 3,15 мин), замораживают и хранят при -18 С. Аффинные хроматографии проводят последовательно на колонке с ковалентно иммобилизованным биотином и на колонке, содержащей 2-иминобиотин, ковалентно присоединенный к носителю. При раздельном применении двух аффинных матриц для адсорбции стрептавидина из интактной культуральной жидкости или из фракции, осажденной (ЫН 4)25 О 4 (70 насыщения) получены препараты стрептавидина, имеющие электрофоретическую чистоту не менее 95 при общем выходе 72 .Недостатками данного метода являются трудоемкость синтеза аффинных матриц,большие затраты дорогих химических реагентов импортного производства и сложность приборного обеспечения. В отличие от заявляемого способа данный метод не может быть эффективным в промышленной биотехнологии производства очищенного стрептавидина.Известен также способ выделения стрептавидина 2 из культуральной жидкости методом колоночной хроматографии на диэтиламиноэтилцеллюлозе. Однако по данному методу выход белка составляет всего лишь 23,2 мг из 1 л культуральной жидкости.Основной задачей настоящего изобретения является упрощение способа выделения и очистки стрептавидина и уменьшение себестоимости целевого продукта.В соответствии с поставленной задачей разработан быстрый и рентабельный метод вь 1 деления и очистки стрептавидина из культуральной жидкости клеток Зггергошусез ау 1111111 без колоночной хроматографии, не требующий сложного приборного обеспечения. Его можно адаптировать К промышленной биотехнологии производства данного белкового продукта.Поставленная задача достигается заявляемым способом получения очищенного стрептавидина, включающем обработку исходной культуральной жидкости нерастворимыми солями металлов, растворимыми сульфатами и осаждением конечного продукта органическим растворителем. В типовом процессе при осуществлении способа в качестве нерастворимой соли двухвалентного металла используют фторид кальция, в качестве растворимого сульфата - сульфат аммония, а в качестве органического растворителя для осаждения конечного продукта - изопропиловый спирт. Количественное содержание стрептавидина определяют по коэффициенту экстинкции Е 28 о( 1 мгмл) 2,7 3.Этапы выделения и очистки стрептавидина и контроль его качества иллюстрируются фигурами.Фиг. 1. Профиль элюции белков культуральной жидкости, осажденных сульфатом аммония (65 насыщения), на колонке с Тоуореаг 1 Н 77-40 1 - 1 см, 11 - 23 см скорость элюции - 7 мл/ч). Объем фракции - 1,2 мл.Фиг. 2. Профиль элюции белков культуральной жидкости, осажденных сульфатом аммония (65 насыщения), после обработки культуры клеток фторидом кальция. Колонка с Тоуореаг 1 Н 77-40 1 - 1 см, 11 - 23 см скорость элюции - 7 мл/ч). Объем фракции - 1,2 мл.Фиг. 3. Профиль элюции стрептавидина, очищенного по заявляемому способу на колонке с Тоуореаг 1 Н 77-40 1 - 1 см, 11 - 23 см скорость элюции - 7 мл/ч). Объем фракции 1,2 мл.Фиг. 4. Хроматография фракции белков, осажденных из культуральной жидкости сульфатом аммония при насыщении 65 (А), и очищенного по заявляемому способу стрептавидина (Б) на колонке с кальций тартратным гелем 1 - 1 см, 11 - 1 см скорость элюции - 30 мл/ч). Использован линейный градиент натрий фосфатного буфера (22 О мл,0-0,1 М НФБ, рН 7,4).Фиг 5. Спектральные характеристики стрептавидина, очищенного по заявляемому способу (А), и стрептавидина, выпускаемого фирмой 5191121 (Б).Фиг. 6. Связывающая способность твердофазного реагента на основе иммобилизованного стрептавидина для определения тироглобулина (ИРМА-Тг-СТ) 1 - стрептавидин фирмы А 111 ег 511 а 111, 2 - стрептавидин, выделенный и очищенный по заявляемому способу.Фиг. 7. Электрофорез препаратов стрептавидина в 15 полиакриламидном геле 1-3 белок, выделенный по заявляемому способу, 4 - стрептавидин фирмы 51311121, 5 - стрептавидин фирмы А 111 ег 511 а 111, 6 - стандартная смесь белков с молекулярными массами (Мг) 67,60, 45 и 30 кДа.Способ осуществляют следующим образомЭтап 1. В 1,5 л свежей культуральной жидкости желто-коричневого цвета растворяют при перемешивании 8,4 г фторида натрия и через 5-10 мин приливают 20 мл раствора хлорида кальция (-5 М р 1,39 г/смз), перемешивают образовавшуюся суспензию нерастворимого фторида кальция 5-10 мин и центрифугируют 5-10 мин при 3000-4000 об/мин. Полученный осадок отбрасывают.Отработаны аналитические методы использования других нерастворимых солей металлов для удаления части примесных белков и пигментов (Са 3(РО 4)2, М 53(РО 4)2, А 1 РО 4,СаНРО 4, 2113(РО 4)2). Наиболее эффективным оказался СаР 2.Этап 2. В надосадочную жидкость, полученную на этапе 1, прибавляют при перемешивании сульфат аммония из расчета 400 г на 1 л жидкости (65 насыщения) и перемешивают в течение 3-4 ч на холоду. Образовавшийся белковый осадок отделяют центрифу В 17044 С 12005.06.30гированием (3000-4000 об/мин, 30-35 мин), супернатант отбрасывают, а осадок растворяют в 60-80 мл дистиллированной воды. Данную смесь можно заморозить и хранить при 18-20 С.Этап 3. С целью получения очищенного препарата эту суспензию центрифугируют(3000-4000 об/мин, 10-15 мин). Осадок отбрасывают, а в супернатант прибавляют охлажденный изопропиловый спирт из следующего расчета на 4 мл водного раствора - 7 мл изопропилового спирта. Оставляют на 10 минут при температуре -18-20 С. Образовавшийся осадок отделяют центрифугированием (3000-4000 об/мин, 5-10 мин). Супернатант осторожно, Чтобы не взмутить осадок, сливают или удаляют отсасыванием, осадок растворяют в 20-30 мл дистиллированной воды и повторно осветляют центрифугированием.В результате получают водный раствор чистого стрептавидина с концентрацией 2-3 мг/мл.На этапе 3 были использованы также и другие растворители (ацетон, этиловый спирт). Наиболее эффективным растворителем для осаждения стрептавидина оказался изопропиловый спирт.Проводят контроль качества. Как видно из фиг. 3, стрептавидин, выделенный и очищенный по заявляемому способу, является гомогенным белком (Мг 60000). По спектральным характеристикам (фиг. 5), связывающей способности (фиг. 6) и электрофоретической подвижности (фиг. 7) он идентичен коммерческим препаратам стрептавидина, вь 1 пускаемым фирмами Зйша и Ашегзпаш.Таким образом, физико-химические характеристики стрептавидина, выделенного и очищенного по заявляемому способу, полностью соответствуют требованиям иммуноанализа с использованием ДНК- и РНК-зондов, Широко применяемых в современной медицинской диагностике.В культуральной жидкости в различных партиях содержится 40-70 мг стрептавидина на 1 л.

МПК / Метки

МПК: C07K 1/30, C12P 21/00, C07K 4/06, C07K 1/14

Метки: способ, стрептавидина, выделения, очистки

Код ссылки

<a href="https://bypatents.com/5-7044-sposob-vydeleniya-i-ochistki-streptavidina.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ выделения и очистки стрептавидина</a>

Похожие патенты