Способ получения ингибитора протеаз овомукоида

1/36, 14/81, 61 38/55 НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОТЕАЗ ОВОМУКОИДА(71) Заявитель Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(72) Авторы Петров Петр Тимофеевич Гапанович Владимир Николаевич Царенков Валерий Минович Шингель Кирилл Игоревич Лапковский Михаил Павлович Тюрин Виталий Иванович(73) Патентообладатель Открытое акционерное общество Белмедпрепараты(57) Способ получения овомукоида из белка утиных яиц путем осаждения балластных белков смесью водного раствора кислоты и этанола, отделения осадка фильтрацией или седиментацией, добавления к фильтрату этанола и отделения целевого продукта, отличающийся тем, что осаждение балластных белков проводят этанолом с добавлением соляной или уксусной кислоты для поддержания рН в интервале 4,3-4,6, после отделения осадка раствор, содержащий овомукоид, подвергают концентрированию методом мембранной фильтрации на мембранах с пределом исключения 5-15 кДа, после чего содержание этанола доводят до концентрации 50 и нагревают раствор до 60-70 С до появления устойчивой опалесценции, раствор охлаждают до 20-25 С и фильтруют, а затем для осаждения овомукоида доводят концентрацию этанола в растворе до 70 , поддерживая рН в интервале 3,8-4,2, и осажденный овомукоид отделяют фильтрацией или центрифугированием.(56)1404513 1, 1988... . . ., 1947, . 171,2, . 574-575.4112074, 1978.5339296 , 1993. ЛАПУК В.Х. Вопросы медицинской химии, 1966, т. 12, вып. 4, с. 636-638.4340591, 1982.2077537 1, 1997.5310797 , 1993.8904280, 1993. Изобретение относится к области фармацевтики и медицины, и может быть использовано при создании лекарственных средств, обладающих ингибирующей активностью по отношению к протеазам. Ингибиторы протеаз, как класс биологически активных соединений, подавляющих протеолитическую активность ферментов, представляют собой соединения, выделенные из животных, растительных тканей, а также из грибных культур. Свойства этих соединений и механизм их антипротеолитического действия хорошо изучены 1. Одним из наиболее широко используемых ингибиторов является апротинин(М 6000) - белок, выделяемый из легких или поджелудочной железы крупного рогатого скота и применяемый в качестве субстанции лекарственных препаратов Контрикал,Гордокс, Тразилол и др. 2. Источником многих антипротеазных соединений, среди которых вителлоингибитор(М 62000), овоингибитор (М 49000), овомукоид М 30900 3, является белок яиц птиц. Отличительной особенностью овомукоида белка утиных яиц от его структурного аналога - овомукоида куриных яиц - является высокая ингибирующая активность как по отношению к трипсину и химотрипсину, так и по отношению к сериновым протеиназам бактериального происхождения. Препараты на основе апротинина, проявляя высокое сродство к трипсину и химотрипсину, мало эффективны по отношению к другим наиболее агрессивным при патологии организма сериновым протеиназам - лейкоцитарной и панкреатической эластазе, лейкоцитарному катепсину . Кроме того, лечебный эффект ингибиторов на основе апротинина вследствие низкой молекулярной массы и быстрого выведения из организма, кратковременный. В то же время, ингибитор протеиназ на основе овомукоида из утиных яиц свободен от этих недостатков 4. Известен способ получения овомукоида из белка утиных яиц, предусматривающий добавление к белку яиц при перемешивании равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном соотношении 11,8-2,3, отделение образующегося осадка фильтрованием при температуре 0-5 С, добавление к фильтрату этанола в объемном соотношении этанол фильтрат 3-3,51, удаление надосадочной жидкости декантированием, диализ осадка против дистиллированной воды и высушивание овомукоида. Выход овомукоида составляет до 1 г на 100 мл яичного белка 5 (прототип). Известный метод 5 не обеспечивает получение овомукоида необходимой степени чистоты. Образцы, полученные по прототипу, имеют содержание овомукоида от 85 до 91 . Содержание примесей достигает до 15 и представляют собой высокомолекулярные белки и овальбумин. Использование овомукоида, содержащего такого рода примеси в таком количестве, в качестве субстанции антипротеиназного препарата может приводить к возникновению у больных реакций повышенной чувствительности различной степени тяжести, в том числе, приводящих к анафилактическому шоку. Кроме того, могут возникать явления, характерные для тяжелых аллергических реакций. Более того, способ по прототипу подразумевает обязательное использование трихлоруксусной кислоты и этанола. Использование в качестве осадителя смеси спирта и трихлоруксусной кислоты требует разработки путей утилизации смеси и может создавать экологические проблемы, так как 2 6488 1 спирт из смеси с трихлоруксусной кислотой не может быть регенерирован и повторно использован в производстве из-за образования при регенерации в спирте хлороформа вследствие реакции гидролиза ТХУ при нагревании. Регенерированный спирт из осадительной смеси с ТХУ содержит в среднем 1,2-1,4 хлороформа - токсичного соединения. Целью настоящего изобретения является создание способа, обеспечивающего а) получение высокоочищенного овомукоида с содержанием не менее 98-99(1-2 составляют безопасные для организма человека примеси солей , ацетат натрия), обладающего высокой удельной активностью (порядка 2600 антритрипсиновых ед./мг), при выходе 8-10 г субстанции из кг белка б) исключение из способа трихлоруксусной кислоты - токсичного соединения в) возврат спирта путем регенерации надосадочной жидкости и фильтрата г) исключение процесса охлаждения раствора перед фильтрацией до 0-5 С д) исключение процесса диализа. Поставленные задачи решаются тем, что в способе получения ингибитора протеаз овомукоида при осаждении балластных белков этанолом используют уксусную или соляную кислоты вместо трихлоруксусной кислоты, поддерживая рН в интервале 4,3-4,6 вводят дополнительную стадию обработки овомукоида осадок овомукоида со степенью чистоты 92 , полученный седиментацией, растворяют в вводно-спиртовой смеси с содержанием этанола 40-60 . Раствор нагревают до температуры 60-70 С. Нагрев осуществляют до появления устойчивой опалесценции. После этого раствор охлаждают до комнатной температуры, появившуюся взвесь отфильтровывают. Взвесь содержит примесные белки и овальбумин, имеющие близкие с овомукоидом молекулярные массы и способные вызывать аллергические реакции в организме человека. Фильтрат направляют на стадию выделения овомукоида. Для уменьшения объемов фильтрата проводят его концентрирование путем ультрафильтрации на мембранах с пределом исключения 5-15 кДа. Поддерживая рН раствора в интервале 3,8-4,2 доводят концентрацию спирта в фильтрате до 70 , а затем, охлаждая раствор до комнатной температуры, проводят осаждение овомукоида. Осадок овомукоида растворяют в воде для инъекций, удаляют остаточный спирт и методом высокоэффективнойхроматографии контролируют степень очистки. Степень чистоты должна составлять 98-99 . Ниже приведены примеры конкретного исполнения заявляемого изобретения. Пример 1. Стадия 1. В стеклянный стакан емкостью 5 л помещают 1 л белка утиных яиц. При постоянном интенсивном перемешивании добавляют 1 л осаждающей смеси (этиловый спирт 3 М уксусная кислота, при объемном соотношении этанолакислота 73). Контролируют рН раствора, поддерживая его в интервале 4,3-4,6. Раствор перемешивают в течение 30 мин. Происходит коагуляция и осаждение балластных белков, которые удаляют фильтрацией или сепарированием. Отфильтрованный раствор, содержащий овомукоид, собирают и помещают в 5 л емкость, оснащенную обратным холодильником. Стадия 2. При постоянном интенсивном перемешивании к раствору, содержащему овомукоид, добавляют этиловый спирт до его концентрации 50 . Раствор помещают в водяную баню и нагревают его до температуры 60-70 С при постоянном интенсивном перемешивании до появления устойчивой опалесценции. Раствор охлаждают до температуры 20-25 С и направляют на фильтрацию. При этом происходит удаление остаточных примесных белков. Стадия 3. Раствор, содержащий овомукоид, отфильтрованный на стадии 2, концентрируют в 5 раз путем ультрафильтрации с использованием мембран с пределом исключения 5-15 кДа или, не проводя концентрирования, сразу направляют на стадию выделения овомукоида. Стадия 4. В стеклянный стакан емкостью 5 л помещают раствор, полученный на стадии 3. Поддерживают рН раствора в интервале 3,8-4,2 добавлением 0,5 М уксусной кисло 3 6488 1 ты. При постоянном интенсивном перемешивании к раствору овомукоида добавляют этиловый спирт до конечной концентрации его 70 . Перемешивание продолжают в течение 30 мин. Осадок собирают фильтрацией или центрифугированием - это овомукоид, который растворят в воде для инъекций, удаляют остаточный спирт. Чистота препарата, определяемая содержанием овомукоида, составляет 98,5 . Выход овомукоида составляет 9 г (удельная активность, выраженная в антитрипсиновых единицах (АтрЕ) составляет 2600 АтрЕ/мг). Выделенный овомукоид соответствует требованиям ВФС 42 Б-47-97 на субстанцию антипротеиназного препарата Овомин. Пример 2. Стадия 1. В стеклянный стакан емкостью 5 л помещают 1 л белка утиных яиц. При постоянном интенсивном перемешивании добавляют 1 л осаждающей смеси (этиловый спирт 1 н соляная кислота, при массовом соотношении этанолсоляная кислота 91). Контролируют рН раствора, поддерживая его в интервале 4,3-4,6. Перемешивание продолжают в течение 30 мин. Происходит осаждение балластных белков. Образовавшуюся суспензию фильтруют, фильтрат собирают и помещают в 5 л емкость, оснащенную обратным холодильником. Стадии 2, 3, 4 проводят аналогично примеру 1. Чистота препарата, определяемая количеством содержащегося овомукоида, составляет 98,5 . Выход овомукоида составляет 8,4 г (удельная активность, выраженная в антитрипсиновых единицах (АтрЕ) составляет 2800 АтрЕ/мг (табл. 1. Выделенный овомукоид соответствует требованиям ВФС 42 Б-47-97 на субстанцию антипротеиназного препарата Овомин. Пример 3, 4. Аппаратурное оформление, условия осаждения белка и получение фильтрата, содержащего овомукоид на стадии 1 аналогичны примеру 1. Условия проведения стадии 2 приведены в табл. 1. Стадии 3, 4 - аналогичны примеру 1. Пример 5, 6. Аппаратурное оформление, условия осаждения белка и получение фильтрата, содержащего овомукоид на стадии 1 аналогичны примеру 2. Условия проведения стадии 2 приведены в табл. 2. Стадии 3, 4 - аналогичны примеру 2. Выход и чистота овомукоида, полученного по способу, описанному в примерах 3-6,представлены в табл. 1-2. Таким образом, предложенный метод, по сравнению с прототипом, позволяет осуществить основную задачу изобретения - повышение степени чистоты получаемого овомукоида до 98-99 при высокой ингибирующей активности 2700-2800 АтрЕ/мг и исключить из технологического процесса токсичное соединение - трихлоруксусную кислоту, что дает возможность проводить регенерацию этанола из кислотно-спиртовой смеси. Также из технологического процесса исключен процесс диализа, длительностью 48 часов, и тем самым сокращено время получения конечного продукта. Таким образом, заявленный способ по сравнению с прототипом имеет новизну, изобретательский уровень и промышленное применение. Источники информации 1. Мосолов В.В., Биоорганическая химия, 1994, 99,6, 185-190. 2. Машковский М.Д. Лекарственные средства, М., Медицина, 1993, том , С. 76-77. 3. Валуев Л.И., Валуева Т.А., Ванчугова Л.В., Синани В.А., Чупов В.В., Платэ Н.А.,сб. Полимеры медицинского назначения под ред. Н.А. Платэ, Институт нефтехимического синтеза АН СССР, Москва, 1988, с. 7. 4. Патент РФ 2053789 от 10.02.96 г. Бюл.4, 1996. 5. Валуева Т.А., Григорьева Л.И., Мосолов В.В. и др., авт. св-во СССР 14045133 А 1 Способ получения овомукоида (прототип) 4 6488 1 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Таблица 1 Условия проведения операций получения овомукоида по примерам 3 и 4. Объем Объем Соотношение Содержание Температура Выход Содержание Удельная Пример белка, осади- спирт/уксусная спирта на обработки на овому- овомукоида, активность,л теля, л кислота стадии 2,стадии 2, С коида, г Таблица 2 Условия проведения операций получения овомукоида по примерам 5 и 6. Объем Объем Соотношение Содержание Температура Выход Содержание Удельная Пример белка, осади- спирт/соляная спирта на обработки на овому- овомукоида, активность,л теля, л кислота стадии 2,стадии 2, С коида, г Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.