Cпособ экспрессии митогенного белка эндотелиальных клеток человека в Escherichia coli

(54) СПОСОБ ЭКСПРЕССИИ МИТОГЕННО ГО БЕЛКА ЭНДОТЕЛИАПЬНЫХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА В Е 5 СНЕН 1 СНА СОЦ57) Изобретение относится к генетической инженерии. в частности к синтезу митогенного андотелиального белка методом рекомбинантных ДНК. Конструируют рекомбинантные плазмидньпе ДНК. кодирующие фактор роста эндотелиальнык клеток человека. трансформируют полученными ДНК штаммы реципиентов Е, соН. культивируют трансформанты в условиях. обеспечивающих экспрессию белка. и выделяют целевой продукт.Изобретение относится к генетической инженерии. в частности к синтезу митогенного эндотелиального белка методом рекомбинантных ДНК.Фактор роста эндотепиальных клеток(ФРЭК) является митогеном эндотелиальнык клеток Ел утго.ФРЭК выделяют путем осаждения суль-фатом стрептомицина. гель проникающей хроматографией. осаждения сульфатом аммония и аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе. О Выделены многочисленные формы бычьего ФРЭК путем злюирования его линейным градиентом натрийклорида изщенно-фазовой высокожидкостной хроматографией (ВЖХ). Два выделенных полипептида. обозначенные альфа- и бетаФРЭ К. имеют мол.м. 17000 и 20000. Используя указанную методику. бычий ФРЭК. содержащийся в 8500 мл вытяжки из мозга быка (625 к 107 суммарных единиц). концентрируют с выходом в сумме Б мл альфа ФРЭК (0 х 105 единиц) и 3 мл бета-ФРЭК 5.2 х 10 единиц). Сущность изобретения состоит в получе нииФРЭК и его фрагментов. не содержащихдругих белков человеческого происхождения. ФРЭК получают в клетках-реципиентах, при этом конструируют векторы экспрессии. содержащие последовательность ДНК. ко- 7 дирующую ФРЭК. трансформируют пол- ученными рекомбинантами ДНК штаммы Е. со клетокхозяев.осуществляют культи- Овиро-вание трансформаторов в условиях. обеспечивающих экспрессию ФРЭК. и выделяют белок. Вектор экспрессии ФРЭК конструируют путем получения дн-кДНК из МРНКФРЭК и введения дн-кДНК в вектор. мРНК обогащают поли(А)содержащим мРНК материалом посредством хроматографии на олигошйцеллюлозе или поли(у)сефарозе с последующим элюироаанием фракции мРНК. содержащей поли(А)последовательностъ. Поли(А)содержащую мРНК используют для синтеза комплементарной кДНК (онкДН К). используя обратную транскриптазу.В результате синтеза ДНК у Здконца ДНК образуется шпилечная петля, инициирующая синтез двунитевой ДНК. При соответствующих условиях эту шпилечную петлю используют для осуществления синтеза днкДНК в присутствии полимеразы и деоксирибонуклеотидтрифосфатов.Вектор экспрессии обрабатывают с помощью зндонуклеазы рестрикции. которая образует по крайней мередва тупых или липких конца. Дн-кДНК встраивают в вектор.Клоны. содержащие п-олные последовательности ФРЭК. идентифицируют. используя в качестве зонда вставку кДНК рекомбинантов ФРЭК. выделенных во вре мя начального скриннинга библиотекикдНК рекомбинантного фрагмента фагалямбда с олигонуклеотидами, специфическими к ФРЭК. Метод секвенирования нуклеотидов используют для определения последовательности аминокислот, кодированных фрагментами кДНК. Эту информацию можно использовать для определения клонов кДНК ФРЭК при сравнении с известной аминокислотой последовательностью аминоконца бычьего ФРЭК и пептида. выделенного в результате расщепления ФРЭК бромидом цианогена.Тотальную РНК (матричную. рибосомную и транспортную) экстрагируют из вытяжки ствола мозга человека двухдневной свежести. Клеточный осадок в пробирке после центрифугирования гомогенизируют в 5 объемах раствора. содержащего 4 М тиоцианата гаунидина и 25 мм антиеспенивателятечение 15 мин при скорости 6000 об/мин при 10 С. Надосадочную жидкость доводят до рН 5.0 при прибавлении уксусной кислоты и РНК, осажденной 0.75 объемами этанола при -20 С в течение 2 ч. РНК собирают центрифугированием и растворяют е 7.5 М гидрохлорида гуанидина. содержащего 2 мМ цитрата натрия и 5 мМ дитиотреитола. После даух дополнительных осаждений 0.5 объемами этанола оставшийся хлоргидрат гуанидина экстрагируют из преципитата абсолютным этанолом. РНК растворяют в стерильной воде, центрифугированием удаляют нерастворимые вещества и осадок после центрифугирования повторно экстрагируют водой. РНК доводят до концентрации 0.2 М ацетата калия и осаждают при добавлении 2.5 объемов этанола в течение ночи при -20 С.Преципитат тотальной РНК растворяют в 20 мМ нарез-буфера (рН 7.2). содержаще 10го 10 мМ ЭДТА и 1 додецилсульфат-на трия, нагревают до 65 С в течение 10 мин затем быстро охлаждают до 25 С. Раствор РНК затем разбавляют равным объемом воды и прибавляют МаС для доведения конечной концентрации до 300 ММ МаС. Образцы. содержащие до 240 А 25 о единиц РНК. хроматографируют на попи(/)сефарозе. Поли(А)содержащую РНК элюируют 70 раствором формамида. состоящим из 1 мМ нарез-буфера (рН 7.2 и 2 мМ ЭДТА. Элюат устанавливают до концентрации 0.24 М МаС и полученную РНК осаждают 2.5 объемами этанола при -20 С.50 и фракции с незаполненным объемом дополнительно очищаютна колонке в соответствии с инструкциями изготовителя. При инкубации с Ы-нуклеазой получают днкДН-К с тупыми концами. Реакционную смесь. состоящую из 0.2 М цитрата натрия(рН 4.5 0.4 М хлорида натрия. 2.5 мМ аце тата цинка и 0.1 ед. 5-нуклеазы на нг дн нДНК. доводят до конечного реакционного37 С в течение 1 ч. экстрагируют смесью фенол-хлороформ и затем обессоливают на сефадексе (5-50. .Дн-кдНК затем обрабатывают метилазой Е. сот и фрагментом Кленова ДН К-полимеразы 1. кДНК опять обессоливают на сефадексе 6-50. а затем пигируют с 0.5 мкг фосфорилированных линкеров Е. сот, используя Т 4 ДНК-лигазу. Полученную смесь расщепляют эндонуклеазой рестрикции Е. сот и фракционируют в 8 акриламидном геле в трис-боратном буфере. ДНК размером более 1 кб элюируют из геля и извлекают при связывании с колонкой. элюируют 1 М МаСЕ. а затем собирают преципитацией этанолом.Фрагменты ДНК затем вставляют в фрагмент 9 г 11 фага лямбда. расщепленного рестриктазой Е. сот и обработанного фосфатазой. используя ДН К-пигазу Т 4. Получают библиотеку. состоящую из 5.7 х 10 фагов. 65 которой составляют рекомбинантные фаги. Библиотеку фагов амплифицируют продуцированием штоков при 42 С на штамме Е. соП У 1088 сир-Е вирР ттс В тгр Р леев паи м топ А 21 ш А Рас и 169(ргоснТпб). К важным генетическим призна кам указанного штамма относятся (1) вор Р(необходимый для супрессии амбар-мутации фаза по З-гену). (2) пес Н нас М). необходимые ДЛЯ предотвращения рестрикциичужеродной ДНК до модификации клеткихозяина и (3) 1 ас И 169 (ргос Тп 5). и (4)(рМС 9)(Ьас 1-несущее производное плазмиды рБК 322. которое подавляет в присутствии индуктора экспрессию чужеродныхгенов. которые могут разрушать фат и/или тДля скриннинга библиотеки кднк ФРЭК. содержащей рекомбинантные фаги,клетки фагов с титром 1.5 х 105 высевают на чашке на газон штамма Е. со У 1 О 90 А ас И 169 рго А А оп ага 0139 зтгд зир Г (тгр С 22 Тп 010) (рМС 9) и инкубируют при 42 С в течение 6 ч. После охлаждения чашек в холодильнике в течение ночи их накрывают нитроцелпюлозным фильтром. Положение фильтра маркируют иголкой. Через минуту фильтр удаляют и дают просохнуть при комнатной температуре. С каждой чашки получают двойной фильтр. кроме того. что фильтр оставляют в контакте с чашкой в течение 5 мин. Затем готовят все фильтры для гибридизации. Указанная методика включает денатурацию ДНК в 0,5 М МаОН с 1.5 М МаС 1. нейтрализацию в буфере 1 М трис-НСЬ рН 7.5. и 1.5 М нас и нагревание фильтров в течение 2 ч в вакууме при 80 С. уДля скриннинта библиотеки кДНК ствола головного мозга человека для получения клонов, содержащих ФРЭК-вставки. конструируют специфический олигонуклеотид. Указанный олигонуклеотид базируется на анализе частичной аминокислотной последовательности концевых аминогрупп ФРЭК. Бычий ФРЭК выделяют в виде двух форм, обозначенных как альфа-и бета-Ф РЭК. которые отличаются только аминокислотами. обнаруженными у соответствующих аминоконцов Последовательность выводят из масс-спектрального анализа с быстрой атомной, бомбардировкой и определяют аминокислотный состав триптического пептида с концевой аминогруппой. По-видимому. аминоконцевая блокирующая группа ацетилирована. Если интактный бета-ФРЭК расщеплен трипсином. то. как определено. вторая аминокислотная последовательность с аминоконцом, найденная в бетац а не в альфа-ФРЭК. начинается с Рпе Азп еи Данная последовательность также обфибробластного фактора роста. концевая аминогруппа ФРЭК представляет Азп Туг узи является эквивалентом бета-ФРЭК без аминоконцевой злонтации.Для конструирования олигонуклеотида ВЫБИПЭЮТ ПОСПВДОВЭТЭПЬНОСТЬ ЭМИНОКИСлот Не 1 ео Рго Азл оку Ттг На Азр СНу Ни у. соответствующую 19 29 включенням аминокислот альфа-ФРЭК. Вместо создаНИЯ смеси из олигонукпеотидов, охватываюЩих все возможные кодирующие последовательности (вследствие деградации генетического кода). конструируют длинный уникальный опигонуклеотид. Такие олигонукпеотид-затравки. как показано ранее. являются эффективнымивондами при скриннинге комплекс-ДН К.При конструировании ФРЭК-зонда используют три критерия (1) исключают динуклеотидную пару СБ. Данный подход основан на недостаточной встречаемости СВ-пар динуклеотида в ДНК прокариота. В тех случаях. когда возможно. используют данные о предпочтительной утилизации кодона. Когда оба эти подхода не информативны. возможно необычное связывание пар оснований. Этот подход основан на природной частотности пар оснований 6 Т. Т. А и С которое возникает при взаимодействии между антикодонами тРНК и кодонами мРНК.Примерно 30 моль олигонуклеотида раз диоактивно метят путем инкубации с 32 ргамма-АРТ и Т 4 полинуклеотид-киназой. Полученные по методике. указанной выше. нитроцеллюлозньте фильтры предварительно гибридизуют при 42.С в 6 х ЗЗРЕ-буфере(1 х Денхардт-раствора содержит по 0.02 фикола. поливинилпирролидона. бычьего сывороточного альбумина). 5 растворе сульфата декстрана и 100 мкг/мл денатурированной ДНК спермы лосося. Через 4 чридизацию продолжают в течение ночи при 42 С. Негибридизованный зонд удаляют вмИз скриннированньлх 1.5 х 10 кланов 2 клона. дают положительные радиоавтографические сигналы после экспозиции в течение ночи. Эти клоны очищают до гомогенного состояния повторными циклаМИ ОЧИСТКИ. ИСПОЛЬЗУЯ ВЫШВУКВЗЭННЫЙ ОНИгонуклеотид в качестве гибридизационного зонда.Два клона. которые выделены. клоны 1 и 29 ФРЭК. анализируют более детально. При переваривании с Е. сон в клонах 1 и 29 обнаруживают кдНК-вставки длиной 2.2 кб и 0.3 кб соответственно. При ник-трансляции клонированной кдНК и последующем ее использовании в качестве радиомеченого зонда в блат-гибридизации по Саузерну об 7 1804480 8наруживают. что клоны 1 и 29 представляют собой связанные и перекрывающиеся клоны.Более-детально клоны 1 и 29 анализируют по следующей методике. конструируют два дополнительных олигонуклеотида на основе аминокислотной последовательности бычьего ФРЭК. Указанные олигонуклеотиды конструируют на основе таких же подходов. которые используют при конструировании олигонуклеотидз,применяемого для выделения клонов 1 и 29. Эти два нуклеотида. а также олиго(оГ)1 в радиоактивно метят в киназной реакции. как указано выше. и затем используют в качестве гибридизационных зондов в блот-анализе по Саузерну. Полученные данные этого анализа показывают, что кДНК-вставка 0.3 кб клона 29 гибридизуется с 1 и П олигонуклеотидами ФРЭК. а не с Ш или олиго(оТ)1 В-нуклеотидами кДНК-вставка 2.2 кб клона 1 гибридизуется с 1, Н, Н олигонуклеотидами. а также с олиго(оТ 1 е-нуклеотидом.Из этих данных и последующего определения нуклеотидной последовательности клонов 1 и 29 видно. что 3-конец клона 1 заканчивается поли(А)-хвостом. При гибридизации клона 1 с олигонуклеотидом Ш ФРЭ К, которая происходит на основе вырезания цианогенбромидом продукта бычьего ФРЭК. а также с олиго (оТЪв-нуклеотидом указанный клон, как предполагают. включает оставшуюся кодирующую последовательность для апьфа- и бета-форм ФРЭК. а также длинную (более 1 кб) Т-концевую фланкирующую последовательность.методу терминации цепи. При анализе нуклеотидной последовательности обнаруживают открытую рамку считывания из 464 нуклеотидов, кодирующую ФРЭК человека. Установлено. что 155 аминокислот ФРЭК человека фланкированы кодонами блокировки трансляции. Аминокислотой с концевой МН 2-группой бета-ФРЭК человека,выделенной из кДНК-последовательности,является метионин, который. по всей вероятности. выступает в качестве остатка инициации трансляции. На основе указанных данных. а также с негидрофобной приро-дой первых 15-20 аминоконцевых остат ков высказывается предположение. что бета-ФРЭК человека синтезируют без сигнального пептида с концевой МН 2-группой. Аминокислотная последовательность с концевой аминогруппой бычьего бета-ФРЭК. расщепленная трипсином. а также бычьегоальфа-ФРЭК идентична аминокислотной ПОСПЕДОВЭТЕЛЬНОСТИ. ВЫЕЕДННОЙ ИЗ ПОСЛЕ довательности нуклеотидов клонов 1 и 29 лямбда ФРЭК. Полная гомология между двумя указанными видами. как установлено. составляет более 95.При Моппегп-блот-анализе устанавливают. что мРНК ФРЭК представляет вид единичной молекулы, которая мигрирует вместе с 28 3 рРНК. С учетом допускаемой погрешности в расчетном размере 28 5 рРНК приблизительный размер мРНК ФРЭК составляет 4.8 11.4 кб. Последовательности. кодирующие зрелые формы как альфа-, так и бета-ФРЭК закодированы в пределах клонов 1 и 29 ФРЭК. которые вместе имеют размер примерно 2.3 кб. Таким образом. указанные данные демонстрируют. что область 5 и фланкирующая последовательности кодирующие ФРЭК. довольно протяженные (примерно 2.5 11.4 кб.Из клонов 1 и 20 вырезают кДНК-вставки посредством гидролиза Е со и субклонируют в ру 08 у сайта Е сот. Плазмиду,сконструированную из клона 1. обозначают как рВН 13. а плазмиду. образованную из клона 29. как рЕ) Н 14. Указанные плазмиды депонируют в Американской коллекции типоеых культур. 12301 Рагкйашп Вгйуе. Носи/Н АТСС 20852. Плазмиде из клона 1. то есть рВ Н 15. присваивают номер АТСС 53336, а плазмиде из клона 29. то есть рЕ) Н 14, АТСС 53335.представляет экспериментальные методики. которые предусматривают получение фактора роста эндотелиальньлк клеток человека. не содержащих других белков челове ческого ПРОИСХОЖДЕНИЯ. ФРЭК применяют для выращивания и амплификациии зндотелиальных клеток в культуре. В настоящее время ФРЭК. используемый для выращивания клеток. экстрагируют из бычьего мозга, Этот неочищенный бычий ФРЭК является мито геном эндотелия аллантоисной вены человека. Использование гепарина с ФРЭК иматрикса на основе фибропектина позволяет получить стабильные клоны эндотелиальных клеток. Рекомендуемая концентрация сырого бычьего ФРЭКдля использования в качестве митогена п унго составляет 150 мкг на мл питательной среды. Рекомбинантный ФРЭК человека. полученный таким образом. пригоден в качестве замены бычьего неочищенного ФРЭК при культивировании Ел что эндотелиальных клеток человека и других меэенхимньлх клеток для научных исследований. Полага