Способ получения ингибитора трипсина

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ТРИПСИНА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Иванов Олег Александрович Домаш Валентина Иосифовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт экспериментальной ботаники имени В.Ф.Купревича Национальной академии наук Беларуси(56)698623, 1979.54993 , 2003. Ботаника. Исследования. - Минск Право и экономика, 2009. - С. 384-392.42847 , 2009. ДОМАШ В.И. Доклады Академии наук БССР. - 1991. - Т. 35. -11. С. 1039-1041. ПОКРОВСКИЙ С. Н. и др. Биоорганическая химия. - 1978. - Т. 4. -2. С. 269-275. ДУНАЕВСКИЙ Я.Е. и др. Биохимия. 1994. - Т. 59. - Вып. 7. - С. 990-996. СЧКАР Л.А. Розробка технолог одержання нгбтора трипсину з насння совивчення його властивостей Автореф. дис. - Харкв, 2002.1162081 1, 1991.6-157599 , 1994.2-76900 , 1990.(57) Способ получения ингибитора трипсина из растительного сырья, при котором корневища золотарника канадского измельчают до размера частиц не более 0,3 мм, заливают раствором 0,2 М хлористого натрия и выдерживают в течение 12 ч при 4 С для экстракции белков, смесь центрифугируют при 5500 об/мин в течение 30 мин при 4 С, экстракт подкисляют 0,5 н соляной кислотой до 4,0 для осаждения балластных белков, которые отделяют центрифугированием при указанных выше условиях, из надосадочной жидкости высаливают белки при 80 -ном насыщении экстракта сульфатом аммония, отделяют высоленные белки центрифугированием при указанных выше условиях, осадок суспендируют в воде и подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 20-24 ч при 4 С, после диализа суспензию хроматографируют на ионообменном сорбенте диэтиламиноэтил-сефароза с использованием ступенчатого градиента хлорида натрия с получением ингибиторной фракции белков с активностью, превышающей не менее чем в 5 раз ингибиторную активность исходного растительного сырья, полученную фракцию белков подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 20-24 ч при 4 С,хроматографируют на акрилексе Р-30 и собирают фракции белков с удельной ингибиторной активностью не менее 7000 мИЕ/мг белка, собранные фракции лиофильно сушат до влажности не более 5-7 . 18605 1 2014.10.30 Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения ингибитора трипсина. Известен способ получения ингибитора трипсина путем экстрагирования измельченных семян гороха, высаливания сульфатом аммония, хроматографии и диализа, причем экстрагирование проводят из семян гороха абиссинского дистиллированной водой, экстракт подкисляют до 4,0-4,3 и хроматографируют на диэтиламиноэтил-целлюлозе при 8,15-8,28 1. Однако этот способ требует использования семян культурных растений, препарат не является гомогенным, и этот способ не позволяет изготовить препарат с высокой удельной активностью. Задачей изобретения является расширение сырьевой базы получения гомогенного препарата ингибитора трипсина и повышение его удельной активности, что способствует повышению эффективности и удешевления при использовании его в качестве лекарственного средства в медицине и научных исследованиях. Поставленная задача достигается тем, что в способе получения ингибитора трипсина из растительного сырья, при котором корневища золотарника канадского измельчают до размера частиц не более 0,3 мм, заливают раствором 0,2 М хлористого натрия и выдерживают в течение 12 ч при 4 С для экстракции белков, смесь центрифугируют при 5500 об/мин в течение 30 мин при 4 С, экстракт подкисляют 0,5 н соляной кислотой до 4,0 для осаждения балластных белков, которые отделяют центрифугированием при указанных выше условиях, из надосадочной жидкости высаливают белки при 80 -ном насыщении экстракта сульфатом аммония, отделяют высоленные белки центрифугированием при указанных выше условиях, осадок суспендируют в воде и подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 20-24 ч при 4 С, после диализа суспензию хроматографируют на ионообменном сорбенте диэтиламиноэтил-сефароза с использованием ступенчатого градиента хлорида натрия с получением ингибиторной фракции белков с активностью, превышающей не менее чем в 5 раз ингибиторную активность исходного растительного сырья, полученную фракцию белков подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 20-24 ч при 4 С, хроматографируют на акрилексе Р-30 и собирают фракции белков с удельной ингибиторной активностью не менее 7000 мИЕ/мг белка,собранные фракции лиофильно сушат до влажности не более 5-7 . Поставленная задача достигается тем, что совокупность заявленных признаков позволяет получить из корневищ широко распространенного в Республике Беларусь инвазивного видапрепарат ингибитора трипсина, который может быть использован в медицине и научных исследованиях. Пример 1 получения гомогенного ингибитора трипсина. 100 г сухих корневищ золотарника канадского ( ) измельчают на лабораторной мельнице до гранул диаметром не более 0,3 мм, заливают раствором 0,2 М хлористого натрия и выдерживают в течение 12 ч при 4 С для экстракции белков, смесь центрифугируют при 5500 об/мин в течение 30 мин при 4 С, экстракт подкисляют 0,5 н соляной кислотой до 4,0 для осаждения балластных белков, которые отделяют центрифугированием при указанных выше условиях, из надосадочной жидкости высаливают белки при 80 -ном насыщении экстракта сульфатом аммония, отделяют высоленные белки центрифугированием при указанных выше условиях, осадок суспендируют в воде и подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 20-24 ч при 4 С, после диализа суспензию хроматографируют на ионообменном сорбенте диэтиламиноэтил-сефароза с использованием ступенчатого градиента хлорида натрия на коллекторе фракций, что детально поясняется графиком, отображенным на фиг. 1, где на осиизображен объем элюата, на осипоглощение раствора белка при 280 нм (кривая 1, фиг. 1), на оси-ингибирования трипсина (кривая 2, фиг. 1), на оси- молярная концентрация , кривая 3. Из полученного графика хроматографии видно, что ингибирует трипсин белок только первого пи 2 18605 1 2014.10.30 ка. Активность ингибиторной фракции (кривая 2, фиг. 1) не менее чем в 5 раз превышает ингибиторную активность исходного растительного сырья, полученную фракцию белков подвергают диализу против дистиллированной воды в течение 20-24 ч при 4 С, хроматографируют на колонке (702 см) с акрилексом Р-30, уравновешанной дистиллированной водой. Элюцию осуществляют дистиллированной водой при скорости тока жидкости в колонке 20 мл/ч. Общий вид элюции изображен на фиг. 2, где на осиотображен объем элюата, на оси - поглощение раствора белка при 280 нм (кривая 4, фиг. 2), на оси- ингибирование трипсина выходящим белком (кривая 5, фиг. 2). Собирают фракции белков с удельной ингибиторной активностью не менее 7000 мИЕ/мг белка (таблица), собранные фракции лиофильно высушивают до влажности не более 5-7 . Затем проводят электрофорез в 15 -ном полиакриламидном геле при силе тока 20-25 мА и напряжении 120 в течение 1,5-2 ч и получают электрофоретические зоны. Наличие одной зоны на электрофореграмме констатирует получение гомогенного ингибитора трипсина, а при наличии двух и более электрофоретических зон констатируют отсутствие гомогенности полученного ингибитора трипсина, что конкретно подтверждается фотографией электрофореграммы, отображенной на фиг. 3, где 6 - пластинка, на которой размещен слой геля 7 и имеется ячейка 8, в которой размещены белки-маркеры 9, имеющие разную молекулярную массу, обозначенную на шкале 10. Пластинка 6 снабжена шкалой 11, на которой размещена лунка 12 с отображением электрофоретического спектра белков грубого экстракта, лунка 13 - после ионообменной хроматографии, лунка 14 - после гель-хроматографии на акрилексе. Электрофорез показывает наличие в нем одного ингибитора с молекулярной массой 17,5 кДа. Так, в лунке 14 белок имеет одну ярко выраженную электрофоретическую зону 15 с молекулярной массой 17,5 кДа, что подтверждает гомогенность ингибитора трипсина. Общая схема получения препарата представлена в таблице. Стадии и степень очистки ингибитора трипсина из корневищ золотарника канадского ( ) Общая ингибиУдельная акБелок,Степень Стадия очистки торная активтивность,мг очистки ность, мИЕ мИЕ/мг белка Ингибитор трипсина, полученный в 228750,5 380,95 600,5 1 результате экстрагирования Ингибитор трипсина, полученный в результате хроматографии на ДЭАЕ 31790,14 9 3532,24 5,9 сефарозе Ингибитор трипсина, полученный в результате гель-хроматографии на 15060,9 2,1 7171,8 11,9 акрилексе Р-30 Из указанных выше 100 г сухих корневищ золотарника канадского получают 46 мг гомогенного препарата ингибитора с удельной активностью 7175 мИЕ/мг белка. Предлагаемый способ получения ингибитора трипсина из корневищ золотарника канадского обеспечивает более высокий выход активного ингибитора (из 100 г сухих корневищ - 46 мг препарата гомогенного ингибитора трипсина). Препарат с успехом может быть использован в медицине и для научных исследований. Предлагаемый способ позволяет получить гомогенный ингибитор трипсина с удельной активностью 7175 мИЕ/мг белка, в то время как у прототипа (смотри А.с.698623.) получаемый ингибитор не гомогенен и имеет более низкую удельную активность. Источники информации 1. А.с. СССР 698623, 1979 (прототип). 3 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4