Штамм бактерий Salmonеlla choleraesuis КМИЭВ-В131 – штамм-антиген

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(72) Авторы Амосова Любовь Александровна Ломако Юрий Васильевич Гусев Анатолий Алексеевич Опарина Ирина Владимировна(73) Патентообладатель Республиканское научно-исследовательское дочернее унитарное предприятие Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского(56) КИРИЛЛОВА В.В. Селекционированные штаммы сальмонелл для изготовления инактивированных вакцин против сальмонеллеза животных Автореф. дисс. М., 1988. - С.13-14, 20-21.20803 А 4, 2009.2255763 С 2, 2005.1577116 С, 1995. Промышленная технология производства противобактерийных препаратов. - М. ИКЦ Академкнига, 2006. - С. 209-211.(57) Штамм бактерийКМИЭВ-В 131 - штамм-антиген. Изобретение относится к области ветеринарной микробиологии и может быть использовано в биотехнологии для приготовления вакцин, диагностических препаратов, а также получения гипериммунных сывороток и в ветеринарии для профилактики сальмонеллеза животных. В ветеринарной микробиологии и биотехнологии применяют ряд штаммов-антигенов сальмонелл. Так, известен аттенуированный производственный штамм сальмонелл .9, который представляет собой супрессорный ревертант, полученный из стрептомицинзависимого мутанта. Данный штамм обладает следующими признаками Культуральные свойства и морфология. Подвижные грамотрицательные палочки без спор, капсул и перитрий. На МПБ образует колонии в -форме (гладкие, прозрачные, бесцветные, гомогенные, с ровными краями), в МПБ вызывает равномерное помутнение через 12-14 ч роста, без пленки, пристеночного кольца и осадка. Ферментативные свойства. Ферментирует с образованием кислоты и газа глюкозу,мальтозу, маннит, ксилозу, арабинозу, дульцит, сорбит не ферментирует сахарозу, лактозу, рамнозу, не образует индол, образует сероводород. Серологические свойства. Агглютинируется сальмонеллезными - и -сыворотками. Патогенность. Вызывает гибель не более 2 из 10 белых мышей массой 16-18 г при подкожном введении 10 млн. м. т. 1. 17124 1 2013.06.30 Недостаток штамма сальмонелл .9 заключается в том, что он используется для производства живых вакцин и при ослаблении резистентности животных может спровоцировать вспышку заболевания либо стать причиной сальмонеллоносительства а также вакцина на его основе может обладать иммуносупрессивным действием и усиливать состояние иммунодефицита 2. Так, известен эпизоотический штамм сальмонелл .7. Данный штамм обладает культурально-морфологическими признаками, типичными для бактерий рода. Антигенная структура штамма .7 по -антигену представлена антигенами 6, 7, по -антигену - антигеном с 3. Недостатком штамма является то, что в его антигенной структуре отсутствуют-антигены 1, 5, что может быть причиной недостаточной специфичности профилактических и диагностических препаратов на его основе. Так, известен производственный штамм сальмонелл .370, использованный нами как прототип. Штамм обладает следующими свойствами. Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные палочки с закругленными концами, длиной 1,0-6,0 мкм, шириной 0,4-0,6 мкм, подвижные. Хорошо растет на обычных питательных средах, на бульоне образует осадок, равномерное помутнение среды, пленку и пристеночное кольцо. На ПЖА растет по всему столбику среды. Физико-биологические свойства. Аэроб, способный расти в микроаэробных условиях. Оптимум 7,2 при температуре 37 С. Ферментативные свойства. Не расщепляет мочевину, индол не образует, выделяет сероводород, глюкозу, маннит, ксилозу, сорбит, арабинозу, дульцит, имеет ферменты лизиндекарбоксилазу и орнитиндекарбоксилазу. Серологические свойства. Агглютинируется сальмонелезными сыворотками -6, 7 Н с, 1, 5. Патогенность. Патогенен для белых мышей, ЛД 50 составляет 12,03,2 микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Иммуногенность. ЕД 50 для морских свинок составляет 0,341060,12 микробных клеток. Ростовые свойства. При культивировании в МПБ Хоттингера в течение 24 ч накопление бактериальной массы составляет 45 млрд/см 3 4. Недостатком штамма является то, что он не выделен в Республике Беларусь и поэтому формирует менее специфичный иммунный ответ, что может быть причиной меньшей эффективности вакцины на его основе, а также обладает более низкими ростовыми свойствами по сравнению с заявляемым штаммом-антигеном и обладает более низкой иммуногенностью для морских свинок. Задачей предлагаемого изобретения является получение штамма-антигена . , выделенного в одном из хозяйств Беларуси, характеризующегося полноценной антигенной структурой и обладающего высокой способностью к накоплению бактериальной массы на МПБ Хоттингера. Поставленная задача реализуется тем, что штамм бактерий .КМИЭВВ 131 - штамм-антиген выделен в Республике Беларусь, содержит полноценный набор - и-антигенов, характеризуется хорошей способностью к накоплению бактериальной массы, обладает высокой иммуногенностью. Заявленный штамм бактерий .КМИЭВ-В 131 обладает следующими признаками. Таксономическая принадлежность. Предложенный штамм бактерий .КМИЭВ-В 131 - штамм-антиген отнесен к семейству , роду ,виду. Культурально-морфологические признаки. Грамотрицательные палочки с закругленными концами, длиной 1,0-6,0 мкм, шириной 0,4-0,6 мкм, подвижные. Хорошо растет на 2 17124 1 2013.06.30 обычных питательных средах, на бульоне образует осадок, равномерное помутнение среды, пленку и пристеночное кольцо. На ПЖА растет по всему столбику среды. Физико-биологические свойства. Аэроб, способный расти в микроаэробных условиях. Оптимум 7,2 при температуре 37 С. Ферментативные свойства. Не расщепляет мочевину, индол не образует, выделяет сероводород, глюкозу, маннит, ксилозу, сорбит, арабинозу, дульцит, имеет ферменты лизиндекарбоксилазу и орнитиндекарбоксилазу. Антигенные свойства. Агглютинируется сальмонелезными сыворотками -6, 7,с, 1, 5. Патогенность. Патогенен для белых мышей, ЛД 50 составляет 28,0 микробных клеток при внутрибрюшинном заражении. Ростовые свойства. При культивировании в МПБ Хоттингера в течение 24 ч накопление бактериальной массы составляет 47-50 млрд/см 3. Условия хранения. Штамм хранится в защитной среде в лиофилизированном состоянии при влажности не более 3 , от минус 2 С до минус 10 С. Штамм депонирован и хранится в музее культур микроорганизмов РУП Институт экспериментальной ветеринарии им. С.Н.Вышелесского. Заявленный штамм бактерий .КМИЭВ-В 131 - штамм-антиген выделен в Республике Беларусь, содержит полноценный набор - и -антигенов, что характеризует его большую специфичность, в частности, для республики, концентрация микробных клеток за 18 ч культивирования на МПБ Хоттингера составляет 47-50 млрд/см 3, что позволяет увеличить выход микробной массы и удешевить производство иммунологических препаратов на его основе, ЕД 50 для морских свинок составляет 0,161060,11 микробных клеток, что обеспечивает более высокую иммуногенность вакцин на основе заявляемого штамма-антигена. Пример 1. Выделение штамма сальмонелл .КМИЭВ-В 131 - штамма-антигена. Штамм выделяли из печени вынужденно убитого поросенка. Для этого прижигали место отбора пробы шпателем, затем прокалывали прижженную область пастеровской пипеткой, отбирали биопробу, переносили содержимое в пробирку с 5,0 мл МПБ. Культивирование осуществляли в термостате при 37 С в течение 24 ч. Пример 2. Изучение культуральных свойств штамма сальмонелл .КМИЭВ-В 131 штамма-антигена. Для изучения культуральных свойств производили посев из МПБ на питательные среды МПА, агар Эндо и висмут-сульфит-агар. Чашки с МПА и агаром Эндо выдерживали в термостате при 37 С в течение 24 ч, с висмут-сульфит-агаром - в течение 48 ч. Пример 3. Изучение биохимических свойств штамма сальмонелл .КМИЭВ-В 131 штамма-антигена. Биохимические свойства штамма сальмонелл .КМИЭВ-В 131 - штамма-антигена идентифицировали методом биохимических тестов с использованием набора ЭНТЕРОтест 24. 1. Подготовка культуры. Из чистой 24-часовой культуры приготовили суспензию в физиологическом растворе,тщательно гомогенизировали суспензию мутность суспензии соответствовала 1 степени по шкале мутностипараллельно выполнили посев суспензии культуры на МПА для проверки чистоты культуры, ее ростовых свойств, инкубировали в течение 24 ч при 37 С. 2. Подготовка стриппированной пластинки. Подготовили рамку отрезали с трех сторон предохранительную пленку удалили адгезивную пленку с индивидуального стрипа и вставили его в подготовленную рамку, прикрыли крышкой. 3 17124 1 2013.06.30 3. Инокуляция приготовленной бактериальной суспензии в лунки с тестами. Суспензию бактерий тщательно встряхнули инокулировали по 0,1 мл суспензии во все лунки в соответствующих рядах пластинки после инокуляции добавили в лунки , ,ипервого ряда (тесты , 2, , , , ) по 2 капли парафинового масла. 4. Инкубация. После инокуляции закрыли пластинку крышкой вложили пластинку в полиэтиленовый пакетик, конец которого загнули, чтобы инокулят не высыхал при инкубации инкубировали инокулированную пластику в течение 24 ч при 37 С. 5. Учет результатов. Проверили рост и чистоту культуры на контрольной чашке. Добавили реактивы в следующие лунки 1-й ряд, лунка(тест ) - 2 капли реактива для теста ИНДОЛ 3-й ряд, лунка(тест ) - по одной капле реактива ВПТи ВПТПластинку инкубировали в течение 30 мин при температуре 35-37 С после 30-минутной инкубации добавили во 2-й ряд, лунка(тест ), 1 каплю реактива для теста ФЕНИЛАЛАНИН. Учитывали результаты всех реакций ЭНТЕРОтест 24 по таблице Интерпретация реакций. Исследование подтвердило. Пример 4. Изучение патогенности штамма сальмонелл .КМИЭВ-В 131 - штаммаантигена на белых мышах. Изучение патогенности штамма проводили на 10 белых мышах массой 16-18 г, которым внутрибрюшинно инъецировали 300 млн. суспензии культуры на физиологическом растворе. Учет гибели животных вели в течение 10 дней. Пример 5. Изучение иммуногенности штамма сальмонеллКМИЭВ-В 131 - штамма-антигена на морских свинках. При постановке эксперимента по определению ИмД 50 сформировано 5 групп морских свинок массой 200-300 г, по 4 головы в каждой. Животных иммунизировали подкожно в объеме 1,0 см 3 инактивированной формалином культурой штамма сальмонелл .КМИЭВ-В 131 - штамма-антигена в дозах 109, 108,107, 106, 105 микробных тел. На 12-й день животные заражены 4 ЛД 50 штамма сальмонелл .КМИЭВ-В 131 штамма-антигена. Учет гибели животных вели 10 дней. ИмД 50 рассчитывали по методу Кербера в модификации Ашмарина. Источники литературы 1. Рубан Е.А., Мельник Н.В., Непоклонов Е.А. Промышленная технология производства противобактерийных препаратов. - М. ИКЦ Академкнига, 2006. - С. 209-210. 2. Максимович В.В. Сальмонеллез свиней. - Минск Ураджай, 1994. - С. 90. 3. Виговська Л.М. Удосконалення системи культивування, збергання та параметрв контролювання виробничих штамв (, , ) Автореф. дис.канд. вет. наук. - Харкв, 2008. - 24 с. 4. Кириллова В.В. Селекционные штаммы сальмонелл для изготовления инактивированных вакцин против сальмонеллеза животных Автореф. дис.канд. вет. наук - М.,1988. - 21 с. (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4