Способ определения следового количества гемопротеинов в плазме крови человека

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЛЕДОВОГО КОЛИЧЕСТВА ГЕМОПРОТЕИНОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Степуро Иван Иванович Адамчук Раиса Ивановна Степуро Андрей Иванович(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(56) Биохимические методы исследования в клинике Справочник. - Москва Медицина, 1969. - С. 349-351.. //(57) Способ определения следового количества гемопротеинов в плазме крови человека,заключающийся в том, что готовят пробу плазмы крови, при этом к 0,05 М калийфосфатному буферу 7,4, содержащему тиамин в концентрации 1,5 мМ и -тирозин в концентрации 1,5 мМ, добавляют плазму крови и пероксид водорода до концентрации 1,0 мМ и инкубируют полученную смесь в течение 60 мин, измеряют интенсивность флуоресценции пробы плазмы крови, по значению которой определяют следовое количество гемопротеинов в плазме крови по калибровочной кривой зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации гемоглобина, полученной с использованием проб растворов гемоглобина, приготовленных аналогично пробе плазмы крови. Изобретение относится к медицине, а именно биохимии, и может использоваться в качестве теста на гемопротеины в биологических средах. У здоровых людей в плазме крови содержатся очень малые количества гемоглобина,который в основном связан с гаптоглобином. Обнаружение повышенного количества растворенного в плазме гемоглобина имеет важное значение для выявления усиленного внутрисосудистого гемолиза, а также для диагностики интоксикаций токсическими соединениями(анилин, бензол и другие ядовитые вещества), синдрома эндогенной интоксикации. Небольшое повышение уровня гемоглобина в плазме крови вызывает сужение кровеносных сосудов, так как оксигемоглобин является эффективной ловушкой оксида азота, который обладает вазодилятаторным действием 1. Мышечный белок - миоглобин - в отличие от гемоглобина содержит одну полипептидную цепь и имеет молекулярную массу 17,6 кДа. Миоглобин является важнейшим кардиомаркером повреждения миокарда. При повреждении миокарда и скелетных мышц миоглобин легко и быстро попадает в кровь и затем быстро экскретируется с мочой. 16640 1 2012.12.30 Определение концентрации миоглобина имеет важное значение у больных с синдромом длительного сдавливания, при обширных травмах мышц, наиболее частым осложнением которых является острая почечная недостаточность. Уровень миоглобина в крови увеличивается при тяжелом электрошоке, термических ожогах, повреждении скелетных мышц,артериальной окклюзии с мышечной ишемией. Из изложенного ясно, что определение малых количеств гемоглобина, миоглобина и других гемопротеинов имеет важное клиническое значение. Наиболее близким к предлагаемому способу является метод определения гемопротеинов в крови путем проведения реакции с бензидином 2. Гемоглобин, а также другие гемопротеины в присутствии пероксида водорода окисляют бензидин с образованием окрашенных в синий цвет продуктов. Концентрация продуктов определяется спектрофотометрически и она пропорциональна содержанию гемопротеина в растворе. Для построения калибровочной кривой используют серию растворов с известной концентрацией гемоглобина. В пробирку, содержащую 0,2 н ацетатный буфер,4,8, добавляют испытуемый гемоглобин, раствор бензидина, пероксид водорода. После смешивания компонентов в течение 3 мин интенсивно развивается синяя окраска, которая нарастает до 4-5 мин,а затем убывает. Поэтому измерения проводят не позднее 5 мин после смешивания компонентов раствора. Предельная концентрация метгемоглобина, которую позволяет определить бензидиновый метод, составляет 0,025 мкМ. Однако широкому использованию бензидиновой пробы в лабораторной практике мешает высокая канцерогенность бензидина, представляющая высокую потенциальную опасность для работающего персонала 3. Задача изобретения - разработка высокочувствительного и безопасного теста на гемопротеины в биологических средах. Поставленная задача решается путем определения следового количества гемопротеинов в плазме крови в присутствии пероксида водорода. При этом отличительным моментом является то, что к раствору гемоглобина или другого гемопротеина дополнительно добавляют тиамин и тирозин и измеряют интенсивность флуоресценции продуктов окисления тиамина. Сущность предложенного способа определения следового количества гемопротеинов в плазме крови человека заключается в том, что в пробирку, содержащую 2 мл 0,05 калий-фосфатного буфера,7,4, содержащего тиамин в концентрации 1,5 мМ и тирозин в концентрации 1,5 мМ, добавляют плазму крови и пероксид водорода до концентрации 1,0 мМ. Затем полученную смесь инкубируют в течение 60 мин, измеряют интенсивность флуоресценции пробы плазмы крови по калибровочной кривой зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации гемоглобина, полученной с использованием проб растворов гемоглобина, приготовленных аналогично пробе плазмы крови. Способ осуществляют следующим образом в пробирку, содержащую 2 мл 0,05 М калий-фосфатного буфера,7,4, добавляют 0,5 мл раствора тиамина (10-2 М),7,4 0,5 мл раствора -тирозина (510-3 М),7,4 0,1 мл цельной плазмы крови (в качестве контроля выступает вода) и 30 мкл пероксида водорода (10-3 М). Затем инкубируют в течение 60 мин, измеряют интенсивность флуоресценции продуктов окисления тиамина(длина волны возбуждения равна 365 нм, максимум флуоресценции равен 450 нм), что позволяет количественно определить концентрацию гемопротеинов. Приводим доказательства возможности осуществления изобретения. Для определения концентрации гемопротеинов мы использовали тот факт, что выход продуктов окисления тиамина возрастает пропорционально содержанию гемопротеинов. Гемоглобин, миоглобин обладают пероксидазной активностью. Они окисляют в присутствии пероксида водорода тиамин с образованием флуоресцирующих соединений(табл. 1). В присутствии тирозина выход флуоресцирующих соединений сильно возрастает. 2 16640 1 2012.12.30 Таблица 1 Влияние концентрации метгемоглобина на выход флуоресцирующих продуктов при инкубации метгемоглобина с тиамином и пероксидом водорода Время Состав раствора инкубации 5 мкМ 1 мкМ 0,5 мкМ 0,1 мкМ 22 раство 222222 Т 22 ра, мин 20 16,5 315 121,5 74,5 24,5 40 18,5 335 121,5 74,5 27,5 95 22,5 310 115,5 68,5 23,5 Концентрация тиаминаравна 1,5 мМ, пероксида водорода - 1,0 мМ. Как видно из результатов, представленных в табл. 1, минимальная концентрация метгемоглобина, которая регистрируется по образованию флуоресцирующих продуктов, составляет величину, равную или больше 0,1 мкМ. В присутствии тирозина выход флуоресцирующих продуктов возрастает в несколько раз (фиг. 1). После 60 мин инкубации реакция замедляется, и дальнейшая инкубация не сопровождается значительным возрастанием флуоресценции (табл. 2). В присутствии тирозина можно измерять концентрации метгемоглобина или других гемопротеинов, начиная с 0,01-0,015 мкМ, что по чувствительности не только не уступает, но даже превышает чувствительность бензидинового метода (табл. 2). Таблица 2 Влияние концентрации метгемоглобина на выход флуоресцирующих продуктов при инкубации метгемоглобина с тиамином, тирозином и пероксидом водорода Состав раствора Время инкубациираствора, мин(0,1 мкМ) 20 1515 645 370 82,5 40 1455 690 460 91,5 95 1305 695 385 81,5 Концентрация тиамина- 1,5 мМ, тирозина - 1,5 мМ, пероксида водорода - 1,0 мМ. Для построения калибровочной кривой используют серию растворов с известной концентрацией гемоглобина. На фиг. 1 показано влияние концентрации метгемоглобина на выход флуоресцирующих продуктов при инкубации метгемоглобина с тиамином и пероксидом водорода при отсутствии (кривая 1) и в присутствии -тирозина (кривая 2). На фиг. 2 показано влияние повторных добавок пероксида водорода на выход флуоресцирующих продуктов при взаимодействии феррильной формы гемоглобина с тиамином. В связи с тем что продукты окисления тиамина устойчивы (в отличие от продуктов окисления бензидина) и не испытывают дальнейших превращений, то повторно добавляя пероксид водорода в пробы (содержащие гемопротеины, тиамин, тирозин) можно дополнительно увеличить выход флуоресцирующих продуктов, а следовательно, повысить чувствительность метода определения гемопротеинов (фиг. 2). Как видно из фиг. 2, наблюдается возрастание выхода флуоресцирующих продуктов после 3-х добавок пероксида водорода в инкубационную смесь (в данном случае б), содержащую метгемоглобин, более чем в два раза. 16640 1 2012.12.30 Таким образом, полученные результаты позволяют заключить, что предложенный метод определения гемопротеинов по образованию продуктов окисления тиамина превышает по чувствительности бензидиновый метод, а используемые реагенты нетоксичны. Источники информации 1.,.,. -// . . - 8 (2002). - .1383-1389. 2. Биохимические методы исследования в клинике / Под ред. А.А.Покровского. - 1969. Москва Медицина. - С. 349-351. 3. Саундерс В.К. В кн. Неорганическая биохимия / Под ред. Г.Эйхгорна. - Москва Мир, 1978. - С. 434-470. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4