Способ определения лизогенности заквасочных бактерий

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИЗОГЕННОСТИ ЗАКВАСОЧНЫХ БАКТЕРИЙ(71) Заявитель Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(72) Авторы Скорб Екатерина Владимировна Свиридов Дмитрий Вадимович Райский Андрей Петрович Белясова Наталья Александровна(73) Патентообладатель Учреждение Белорусского государственного университета Научно-исследовательский институт физико-химических проблем(56).. 1973. - . 25. - . 4. - . 682-684.1291602 1, 1987.721487, 1980.1458387 1, 1989.., 1977. - . 33. . 1. - . 184-191. МУК 4.2.1884-04. Санитарно-микробиологический и санитарно-паразитологический анализ воды поверхностных водных объектов, //// 45/45900/ СКОРБ Е.В. и др. Доклады Национальной академии наук Беларуси. - 2007. Т. 51. -3. - С. 62-66.940520 , 1984.1578189 1, 1990.115547 1, 1984.(57) Способ определения лизогенности заквасочных бактерий, используемых для получения молочнокислых продуктов, включающий культивирование бактерий, облучение УФсветом бактериальной суспензии с последующим ее высевом, инкубирование посева в присутствии чувствительной тест-культуры в течение суток и выявление негативных колоний, отличающийся тем, что облучение УФ-светом осуществляют в присутствии дисперсного диоксида титана - анатаза или смеси анатаза с рутилом, внесенного в количестве 6,7 мг/мл бактериальной суспензии с титром 107 КОЕ/мл, в течение 2 минут. Изобретение относится к области микробиологии и технологии производства ферментированных молочных продуктов и может быть использовано для установления лизогенного состояния заквасочных бактерий (лизогенности). Лизогенные заквасочные бактерии (т.е. содержащие в своих геномах ДНК умеренных фагов) представляют серьезную угрозу для технологических процессов получения ферментированных молочных продуктов, поскольку при изменениях условий окружающей среды и биологического статуса клетки (резкие колебания температуры, кислотности,накопление продуктов метаболизма в культуральной жидкости, появление токсикантов,голодание и др.) может происходить индуцирование профагов к литическому циклу (вы 15017 1 2011.10.30 ходу зрелых вирусов из клетки), следствием чего является фаголизис - явление массовой гибели заквасочных бактерий, сопровождающееся нарушением процесса ферментации молока. Особенно опасно использование лизогенных бактерий в составе многокомпонентных заквасок, поскольку, если в составе таких заквасок окажутся лизогенные бактерии и нелизогенные, но чувствительные к фагу, обусловившему лизогению, произойдет фаголизис 1-3. В связи с этим необходимо проводить тщательную проверку заквасочных бактерий на присутствие в их клетках профагов. Используемые в настоящее время методы, предполагающие воздействие на бактерии какими-либо агентами физической или химической природы (термообработка, ультрафиолетовое (УФ) облучение, воздействие химических веществ 1-4), дают неоднозначные результаты, в том числе вследствие широкого распространения вариантов бактерий, в клетках которых присутствуют дефектные профаги, а также штаммов с устойчивым состоянием лизогении. В качестве прототипа 3 выбран метод определения лизогенности бактерий, предполагающий использование УФ-излучения для того, чтобы добиться выхода зрелых бактериофагов из клеток, что позволило бы определить лизогенность бактерий по негативным колониям фагов на газонах чувствительных культур. К недостаткам прототипа следует отнести 1) невозможность выявления лизогенных бактерий во всех случаях 2) большая длительность УФ-облучения (2 часа и более 3), следствием чего является низкая производительность процесса определения. Задача изобретения - разработка способа определения лизогенности заквасочных бактерий за счет фотокаталитической индукции профагов к литическому циклу для достижения высокой достоверности определения при одновременном повышении экспрессности за счет снижения времени облучения. Поставленная задача достигается тем, что в способе определения лизогенности заквасочных бактерий, используемых для получения молочно кислых продуктов, включающем культивирование бактерий, облучение УФ-светом бактериальной суспензии с последующим ее высевом, инкубирование посевов в присутствии чувствительной тест-культуры в течение суток и выявление негативных колоний, облучение проводят в присутствии дисперсного диоксида титана - анатаз или смесь анатаза с рутилом, внесенного в количестве 6,7 мг/мл бактериальной суспензии с титром 107 КОЕ/мл, в течение 2 минут. Процедура индукции профагов к литическому циклу под действием УФ-облучения в присутствии диоксид-титанового фотокатализатора включает следующие основные стадии 1) получение суточных культур лизогенных бактерий общепринятыми методами 5 2) разведение культур лизогенных бактерий стерильным физиологическим раствором и добавление к полученной суспензии дисперсного диоксид-титанового фотокатализатора 3) облучение перемешиваемой суспензии УФ-светом 4) высев облученной культуры стандартным двухслойным методом 6 с последующим инкубированием посевов в течение суток 5) подсчет числа негативных колоний и определение концентрации бляшкообразующих единиц (БОЕ) в 1 мл суспензии с учетом разведения. Пример 1. Лизогенные молочнокислые бактерии 411 (исходная концентрация 1,2109 КОЕ/мл) культивировали сутки при 30 С в жидкой пептонно-дрожжевойсреде 17, содержащей 0,5 глюкозы, и непосредственно перед анализом разводили до титра 107 КОЕ/мл стерильным 0,15 раствором . После добавления дисперсного Т 2 в количестве 20 мг на 3 мл суспензии последняя подвергалась УФ-облучению (линия 240 нм ртутной лампы высокого давления интенсивностью 15 мВтсм-2) в течение 2 минут. Для регистрации негативных колоний фагов проводили высев методом агаровых слоев нижний 2 15017 1 2011.10.30 слой представлял собой агаризованную (1,0 ) среду 17, содержащую глюкозу (0,5 ),2 (5 мМоль/л) и глицин (0,75 ) верхний слой отличался от нижнего меньшим содержанием агар-агара (0,4 ) и включал 0,1 мл облученной суспензии и 0,2 мл чувствительной тест-культуры. Концентрация бляшкообразующих единиц, определенная после инкубирования посева в течение суток, составила 2,3102 БОЕ/мл. Пример 2. Анализ на лизогенность молочнокислых бактерий .411 проводился так же, как в примере 1, но вместо чувствительного к используемому УФ-облучению диоксида титана в клеточную суспензию вводили нефоточувствительный дисперсный 2 в той же концентрации. Присутствия бляшкообразующих единиц после УФ-облучения продолжительностью 2 минут не обнаружено. Пример 3. Анализ на лизогенность молочнокислых бактерий .411 проводился так же, как в примере 1, но вместо чувствительного к используемому УФ-облучению диоксида титана в клеточную суспензию вводили нефоточувствительный дисперсный 2 в той же концентрации. Концентрация бляшкообразующих единиц, определенная после УФ-облучения в течение 2 часов (т.е. в тех же условиях, что и в случае прототипа), составила 1,2101 БОЕ/мл. Пример 4. Анализ на лизогенность молочнокислых бактерий .415 (исходная концентрация 1,4109 КОЕ/мл), проводился так же, как в примере 1. Концентрация бляшкообразующих единиц, определенная после УФ-облучения в течение 2 мин, составила 1,1102 БОЕ/мл. Пример 5. Определение лизогенности молочнокислых бактерий .415 проводилось так же,как в примере 4, но вместо чувствительного к используемому УФ-облучению диоксида титана в клеточную суспензию вводили нефоточувствительный дисперсный 2 в той же концентрации. Присутствия бляшкообразующих единиц после УФ-облучения продолжительностью 2 минут не обнаружено. Пример 6. Определение лизогеннности молочнокислых бактерий .415 проводилось так же, как в примере 5. Присутствия бляшкообразующих единиц после УФ-облучения продолжительностью 2 часа (т.е. в тех же условиях, что и в случае прототипа) не обнаружено. Важным достоинством заявляемого способа определения лизогенности заквасочных бактерий является то, что он позволяет исключить возможность ошибочного невыявления лизогенных бактерий (как в случае бактерий .415, факт лизогенности которых, в отличие от заявляемого метода, не может быть выявлен с помощью метода-прототипа) и тем самым надежно предупредить негативные последствия использования штаммов лизогенных заквасочных бактерий в процессах ферментации при изготовлении кисломолочных продуктов. Существенно также, что время УФ-облучения при выполнении анализа на лизогенность снижается в 60 раз по сравнению с прототипом. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4