Способ определения устойчивости растений к стресс-факторам

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ РАСТЕНИЙ К СТРЕСС-ФАКТОРАМ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Савченко Галина Евсеевна Кабашникова Людмила Федоровна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ определения устойчивости растений к стресс-факторам, включающий измерение флуоресценции листьев растений, подвергшихся воздействию стресс-факторов и контрольных, отличающийся тем, что для измерения используют листья 4-9-дневных этиолированных проростков, измеряют интенсивность низкотемпературной флуоресценции длинноволновой и коротковолновой форм протохлорофиллида с максимумом свечения при 657 и 635 нм соответственно и по изменению величины отношения интенсивности флуоресценции этих форм для листьев растений, подвергшихся воздействию стресс-факторов, по сравнению с аналогичным отношением этих форм для листьев контрольных растений судят об устойчивости растений, при этом, чем меньше изменяется эта величина, тем выше устойчивость к стресс-факторам. Изобретение относится к физиологии растений и сельскому хозяйству, может быть использовано для характеристики перехода растения в стрессовое состояние и при отборе стрессоустойчивых форм растений в селекции, включая генетически модифицированные растения. Известен способ оценки стрессоустойчивости (солеустойчивости) растений, включающий измерение биофизического показателя - электрического сопротивления листьев 1. Недостатком известного способа является то, что его нельзя применить для оценки действия других стрессовых факторов (например, термо- и засухоустойчивости). Наиболее близким, принятым за прототип, является способ определения устойчивости растений к стресс-факторам путем измерения замедленной флуоресценции образцов рас 12617 1 2009.12.30 тений, подвергающихся воздействию стрессового фактора и без этого воздействия, и последующего сравнения уровней флуоресценции, измеряемой в одно и то же время суток 2. Недостатком известного способа является то, что он может быть применен только к растениям со сформировавшимся фотосинтетическим аппаратом и должен учитывать сложную суточную ритмику изменения измеряемых показателей. Задачей изобретения является упрощение способа определения устойчивости растений к стресс-факторам, повышение точности определения физиологического состояния и стрессочувствительности растений, а также расширение возможностей диагностики границ их стрессоустойчивости на самом раннем этапе развития. Технический результат достигается в способе определения устойчивости растений к стресс-факторам, включающем измерение флуоресценции листьев растений, подвергшихся воздействию стресс-факторов и контрольных. Согласно изобретению, используют листья 4-9-дневных этиолированных проростков, в которых измеряют интенсивность низкотемпературной флуоресценции длинноволновой и коротковолновой форм протохлорофиллида (Пд) с максимумом свечения при 657 и 635 нм соответственно. По изменению величины отношения интенсивности флуоресценции этих форм в листьях растений, подвергшихся воздействию стресс-факторов, по сравнению с аналогичным отношением для листьев контрольных растений судят об их устойчивости, при этом, чем меньше изменяется эта величина, тем выше устойчивость к стресс-факторам. Преимущество использования этиолированных проростков в качестве объекта для диагностики стрессоустойчивости на самом раннем этапе развития растений связано с тем,что в отсутствие фотосинтеза и сформированного фотосинтетического аппарата они наиболее подвержены стрессу и наименее устойчивы и развитие в темноте нивелирует суточные ритмы физиологических процессов. В предлагаемом способе в качестве физиологического параметра для определения устойчивости растений к стресс-факторам используется соотношение двух основных форм предшественника хлорофилла - Пд 3, регистрируемых по низкотемпературным спектрам флуоресценции листа этиолированных проростков длинноволновой формы Пд, флуоресцирующейпри температуре жидкого азота в области 655-657 нм (Пд 657), и коротковолновой формы Пд, флуоресцирующей в этих же условиях при 633-635 нм (Пд 635) 4. В листьях этиолированных растений злаков, выращенных в отсутствие стрессовых воздействий в течение не менее 4 суток при хорошем влагообеспечении при комнатной температуре, преобладает длинноволновая форма Пд 657, содержание которой снижается при старении тканей листа. Оптимальным для измерений является 7-9-дневный возраст проростков. Нами впервые выявлено, что при однократном тепловом шоке (3 ч при 40 С) и дефиците влаги в результате изменения физико-химического состояния мембран этиопластов интенсивность флуоресценции Пд 635 может возрастать, а интенсивность флуоресценции Пд 657 снижаться, что приводит к уменьшению величины отношения интенсивности флуоресценции Пд 657/Пд 635. Обнаруженная нами однотипность реакции этиолированных растений на различные экстремальные воздействия дает возможность рассматривать ее как один из видов неспецифического ответа растительного организма на стрессовый фактор, что позволяет использовать регистрируемое непосредственно в листе соотношение форм протохлорофиллового пигмента как индикатор состояния внутриэтиопластных мембран, характеризующий стрессочувствительность, стрессоустойчивость и жизнеспособность проростка. Способ осуществляют следующим образом. Замоченные семена злаков (или других растений) выращивают несколько суток в полной темноте на водопроводной воде (контрольный вариант), затем подвергают их действию стрессора (высокая температура, обезвоживание или другие воздействия), после чего 2 12617 1 2009.12.30 регистрируют спектры флуоресценции листьев при температуре жидкого азота при длине волны возбуждающего света 440 нм. Чтобы уменьшить биологический разброс данных и повысить их достоверность, измерения проводят на одном и том же участке листа контрольного и опытного вариантов (там, где содержание Пд наиболее высокое). В оптимальных физиологических условиях в таких листьях преобладает флуоресценция формы Пд 657, а при переходе растения в состояние стресса в неблагоприятных условиях растет интенсивность флуоресценции формы Пд 635, что приводит к изменению отношения интенсивности флуоресценции обеих форм. На фиг. 1 представлены спектры флуоресценции 7-дневных этиолированных проростков ячменя в контроле (1) и после теплового шока (2). Температура регистрации спектров -196 С, длина волны возбуждения - 440 нм. На фиг. 2 приведены спектры флуоресценции листьев 9-дневных этиолированных проростков ячменя, выращенных на водопроводной воде (1), и листьев проростков, находившихся в течение 48 ч (с 7 по 9 сутки) в условиях дефицита влаги, создаваемого раствором 3 -ного полиэтиленгликоля (2). Температура регистрации спектров - -196 С, длина волны возбуждения - 440 нм. Сущность изобретения иллюстрируется примерами. Пример 1. Проростки этиолированных растений ячменя (., сорт Гонор) выращивали при 23 С (контрольный вариант), затем часть их подвергали тепловому шоку путем нагревания в темноте в течение 3 ч при 40 С в воздушном термостате (границу продолжительности нагревания и его интенсивность можно раздвигать), регистрировали спектры флуоресценции листьев при -196 С в одних и тех же участках листа и измеряли отношение интенсивности флуоресценции длинноволновой и коротковолновой форм Пд. Средняя величина (фиг. 1) отношения интенсивности флуоресценции Пд 657/Пд 635 для проростков ячменя в контроле составляла 4,170,31, после теплового шока - 1,610,32. Различия между средними арифметическими двух вариантов были статистически достоверными при уровне значимости 0,001 (критерий значимостиравен 5,81). Данные свидетельствуют о высокой чувствительности данного сорта ячменя к используемому тепловому воздействию. Пример 2. Проростки этиолированных растений тритикале (, озимый сорт Дубрава) выращивали при 23 С (контрольный вариант), затем часть их подвергали тепловому шоку путем нагревания в темноте в течение 3 ч при 40 С в воздушном термостате, регистрировали спектры флуоресценции листьев при -196 С в одних и тех же участках листа и измеряли отношение интенсивности флуоресценции длинноволновой и коротковолновой форм Пд. В листьях 7-дневных этиолированных проростков тритикале отношение интенсивности флуоресценции Пд 657/Пд 635 в контроле составляло 5,960,36, а после теплового шока - 4,690,67. Различия между вариантами менее существенны по сравнению с примером 1 и статистически недостоверны (критерий значимостиравен 1,69). Данные свидетельствуют о достаточно высокой устойчивости растений тритикале к использованному температурному стрессу, что подтверждается и другими физиологическими показателями для этой культуры. Пример 3. Проверка границы засухоустойчивости. Для создания водного дефицита проростки ячменя (., сорт Гонор) выращивали в течение 7 суток на водопроводной воде в темноте, а затем половину проростков погружали корнями на 48 ч в 3 раствор полиэтиленгликоля 6000, что приводило к дефициту влаги, в то время как контрольные растения продолжали расти на воде. После этого регистрировали спектры флуоресценции одинаковых участков листьев контрольного и опытного образцов при температуре жидкого азота (фиг. 2). Дефицит влаги приводил к практически полному пе 3 12617 1 2009.12.30 реходу формы Пд 657 в форму Пд 635 (кривая 2), указывающему на недопустимость дальнейшего снижения влагообеспеченности, поскольку было установлено, что проростки в такой ситуации плохо зеленели на свету. Изменение величины отношения флуоресценции длинноволновой (Пд 657) и коротковолновой (Пд 635) форм Пд в листьях этиолированных проростков ячменя при обезвоживании представлено в таблице. Различия между опытными и контрольными вариантами были статистически надежными. Вариант Пд 657/Пд 635, отн.ед. Таким образом, по изменению соотношения форм Пд, вызванному увеличением относительного содержания коротковолновой формы Пд в низкотемпературных спектрах флуоресценции этиолированных листьев, можно судить о переходе растения в стрессовое состояние, а степень превращения длинноволновой формы Пд в коротковолновую может отражать не только его стрессоустойчивость (примеры 1 и 2), но и указывать границу повреждающего действия стресс-фактора (пример 3). Поскольку для измерения спектров флуоресценции достаточно нескольких листьев,способ можно использовать для определения стрессоустойчивости и жизнеспособности дефицитных проростков, например полученных путем генной модификации. Источники информации 1. Патент РФ 2017408, МПК А 01 М 1/04, 1994. 2. Патент РФ 2049385, МПК А 01 М 1/04, 1995. 3. Аверина Н.Г., Рудой А.Б., Савченко Г.Е., Фрадкин Л.И., Чайка М.Т., Беляева О.Б.,Одинцова М.С., Островская Л.К., Филиппович И.И. Биогенез пигментного аппарата фотосинтеза / Под ред. Ф.Ф. Литвина. - Минск Наука и техника, 1988. - С. 35-50, 234-240. 4. - К.,В.,,.-.10 К - 100 К //. - 1999. - . 60. -1. - . 87-98. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4