Способ определения чистоты препаратов плазматических мембран клеток тканей лабораторных животных при отсутствии выраженной генетической патологии

СОЮЗ СОВЕТСКИХ СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИКГОСУДАРСТВЕРНЫЙ КОМИТЕТ ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ ПРИ ГКНТ СССР(71) Институт радиобиологии АН БССРАп Ттргоуео тесптцие тог ргерагапоп от Зкейетаетизые Се Разта тетьгапе. ВюсЫпнса е Вюрпуыса Аска. 1974. ч.345 М 3. р.348 т 358.(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧИСТОТЫ ПРЕПАРАТОВ ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ МЕМБ 2РАН КЛЕТОК ТКАНЕЙ ЛАБОРАТОРНЫХ ЖИВОТНЫХ ПРИ ОТСУТСТВИИ ВЫРАЖЕННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ПАТОЛОГИИ(57) Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения чистоты мембранных препаратов. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том. что измеряют активности 5-нуклеотидазы и фумарат-гидратаэы. а при отношении обогащения 5 нуклеотидазы к обогащению фумарааы по сравнению с первым супернатантом, равному 35 - 40. судят о достаточной чистоте выделенных плазматических мембран. 1 з.п. Ф-лы. 1 табл 1 ил.Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения чистоты мембранных препаратов.Известны способы определения чистоты препаратов плазматических мембран путем измерения активности ряда ферментов. Известен также способ. который предусмат. ривает использование нескольких фермен тов для оценки чистоты плазматических мембран.Недостатками известных способов являются отсутствие универсального биохи МИЧЭСКОГО маркера ДЛЯ СЭВКОПЛЗЗМЭТИЧЗского ретикулума. а также отсутствие интегрального показателя. характеризующего общую загрязненность плазматических мембран другими структурами клетки. т.е. сложность осуществления известного способа заключается в необходимости измерения большого числа ферментов. Целью изобретения является упрощение способа. Способ заключается в том. что измеряют активности 5-нуклеотидазы и фумарат гидратазы (КФ 4.2.1.2). а при отношении обогащения 5-нуклеотидазы к обогащению фумаразы по сравнению с первым супернатантом. равному и более 35 - 40. судят о достаточной чистоте выделенных плазматических мембран.Способ осуществляют следующим образом. А Исследуют только два фермента. один из которых характеризует только количество плазматических мембран, а второй все остальные составляющие клетки (микросо МЫ. ЦИТОЗОЛЬ. МИТОХОНДОИИ).Первым ферментом является 5-нуклеотидааа. вторым фумараза (фумарат-гидратаза).СТЕПЕНИ ОЧИСТКИ ПЛЭЗМЗТИЧЗСКИХ мембран, вводят коэффициент Кф Н/Ф. Сгде Н обогащение фермента плазматических мембран (-нуклеотидазы) в мембран ной фракции по отношению к первому супернатанту (гомогенату)На чертеже представлен график анализа препаратов плазматических мембран. зарязненных в различной степени.Для определения границы достаточнойстепени чистоты мембранных препаратов тнализироеали данные по выделению плазлатических мембран (смлаблицу).Расчет коэффициента Ксг поданным лиературы показывает. что препараты плазиатических мембран. используемые для биохимических.исследований. имеют Ка в области выше 3. что соответствует коэффициенту Кф более 35 40. Таким образом. для характеристики чистоты фракций плазмаических мембран можно использовать измерение активности только двух ферментов (Бднуклеотидазьт и фумарат-гидпатазы) и считать полученные фракции пре паратами плазматических мембран.П р и м е р 1. Гомогенат ткани центритэугируют 1500 о 10 мин, отбирают 1 мл полученного суперналтанта (1 СН) и продолжают выделение мембран по любой методине. Измеряют активность 5 туклеотидазы в СН (53.6 нг Р/мг белка/ч) и в препарате пыделенных мембран (800 кг Р/мг белка/ч). Обогащение Бднукттеотъъдазьп составляетО 8002535 15. измеряют удельную актив ность фумарат-гидратазы в 1 СН (12 нм/мг Ьелка/ч)и в мембранном препарате (ЗА нМ /мг Пенка/ч). Обогащение этого фермента соьтавляет 3112.0 0.26. Рассчитывают коэфоициент Кф 1520,26 58. Полученное значение показывает. что такой ПРВПЗРЗТ нлазматическихмембран может быть иснользован в любых биохимических исследонаниях.рате мембран составляет 75.4 и 997 нг Р/мг белка/ ч соответственно. Обогащение этого фермента 9972754 - 13.2. Удельная активность фумарат-гидратази в 1 СН составила 12.0. а в мембранном препарате 7.8 нМ/мг белка/ч. Обогащение фермента 7.812.0 0.б 5. Рассчитывают коэффициент КФ - 13,2 0,06 - 22.0. Такой препарат нель я считать фракцией плазматических мембран и использовать в биохимических исследованиях. х, П р и м е р 3. Удельная активность 5 нуклеотидазы в 1 СН и мембранном препарате составляет 85,7 и 1564 нг Р мг белка/ч соответственно. Обогащение фермента 15641854 18.2. Удельная активность фумарат-гидратазы в этих препаратах 17.5 и 8.5 нМ/мг белка/ч. Обогащение фермента 85175 - 0.49. Рассчитывают коэффициент Кф 18.20.49 37. Такие препараты можно использовать для определения функцио НЗЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ППЗЗМЗТИЧВСКИХ мембдран. но не для количественного состава.Характерные соотношения активностей маркерных ферментов, получаемых при выделениях плазматических мембран клеток. приведены в таблице.- 1. Способ определения чистоты препаратов плазматических мембран клеток тканей лабораторных животных при отсутствии выраженной генетической патологии. включающий измерение активностей 5-нуклеотидазы и маркерного фермента. характеризующего прочие компоненты клетки. и сравнение результатов измеренийлтлича ющи йсятем. что.сцелью упрощения способа. в качестве маркерного фермента. характеризующего прочие компоненты клетки. используют Фумарат-гидратазу.2. Способ по п.1. отлича ющийся тем. что чистоту препаратов плазматических мембран определяют по формуле КФ Н/Ф. где Н - обогащение 5 туклеотидазы по отношению к исходному препарату Ф обогащение фумарат-гидратазы по отношению к исходному препарату. и при величине Кф. равной и более 35 40. судят о достаточной чистоте препарата плазматических мембран.5 1709219 Обогащен 5 Обогащение Обогащение нуклеотмдазы гпюкозо-бчрос- сукцинатдегидзаказ 421 к Тираж Подписное вниипи Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035. Москва. Ж-ЗБ. Раушская наб. 4/5