Способ ингибирования роста культуры патогенного штамма Pseudomonas aeruginosa

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ РОСТА КУЛЬТУРЫ ПАТОГЕННОГО ШТАММА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ ингибирования роста культуры патогенного штамма,включающий добавление ингибитора в питательную среду с клетками штамма с последующим культивированием при 37 С в течение 24 часов, отличающийся тем, что в качестве ингибитора используют водный раствор, содержащий лизоцим в концентрации 5070 мкг/мл и этилендиаминтетраацетата динатриевую соль в концентрации 10-3-10-2 . Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии, в частности к ингибированию роста культур госпитальных штаммов. Известен способ ингибирования размножения клеток патогенных псевдомонад. Он заключается в том, что за счет добавления в среду культивирования антибиотиков наблюдается ингибирование размножения клеток микроорганизма 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является ингибирование размножения клеток патогенных псевдомонад при добавлении в питательную среду вещества ингибиторного действия. Однако известный способ ингибирования роста культуры патогенных псевдомонад оказывается неэффективным вследствие того, что штаммыобычно устойчивы ко многим потенциально эффективным антибиотикам. Большинство госпитальных штаммовполирезистентны 2. Уже не являются редкостью и панрезистентные штаммы синегнойной палочки - описаны вспышки нозокомиальных инфекций, вызванных такими штаммами 3, 4. Задачей заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего активно ингибировать размножение клеток патогенных штаммов псевдомонад. 15047 1 2011.10.30 Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования роста культуры патогенного штамма, включающий добавление ингибитора в питательную среду с клетками штамма с последующим культивированием при 37 С в течение 24 часов, при этом в качестве ингибитора используют водный раствор, содержащий лизоцим в концентрации 50-70 мкг/мл и этилендиаминтетраацетата динатриевую соль в концентрации 10-3-10-2 М. Использование раствора лизоцима с этилендиаминтетраацетатом натрия позволяет достичь резкого ингибирования внеклеточных желатинолитических протеиназ госпитальных штаммов псевдомонад, исключив использование высокотоксичных ферментных ядов - хлормеркурибензоата или диизопропилфторфосфата. Лизоцим представляет собой фермент мол. массой 15 кДа, выделяемый из белка куриных яиц и обладающий бактериолитическим действием, главным образом, в отношении грамположительных микроорганизмов. Способен стимулировать неспецифическую реактивность организма, оказывать противовоспалительное и муколитическое действие. Применяют местно и внутримышечно при лечении гнойных и хронических септических процессов, при ожогах, обморожениях, конъюнктивитах, эрозиях роговицы и др. 5. Этилендиаминтетраацетат - динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты(Трилон Б) - используют в лечебных целях внутривенно при избыточном отложении солей кальция в организме, артритах с отложением солей, отложении кальция в мышцах, почках, стенках вен, склеродермии, иногда - при эктопических аритмиях и др. 6. Этилендиаминтетраацетат известен и как ингибитор металлопротеиназ, однако согласно имеющимся у заявителя и авторов данным в использованных концентрациях сам он вызывает подавление активности внеклеточных желатинолитических протеиназ бесклеточных супернатантов бульонных культур госпитальных штаммов псевдомонад лишь на 40-45 . Введение смеси лизоцима с этилендиаминтетраацетатом натрия в питательную среду позволяет затормозить размножение клеток патогенных штаммов псевдомонад и резко снизить урожай их биомассы. Пример 1. Суспензию клеток - 100 млн. микробных тел в 60 мкл культуральной жидкости госпитального штамма псевдомонад 74/5 гоб 3 высевают в каждую из двух пробирок ( 1 и 2) с 10 мл мясо-пептонного бульона. В пробирку 1 вносят асептически водный раствор смеси лизоцима с этилендиаминтетраацетатом натрия в концентрации 70 мкг/мл и 10-2 М соответственно, а в пробирку 2 (контроль) - такой же объем стерильной дистиллированной воды. Закрывают пробирки ватно-марлевыми пробками. Обе пробирки инкубируют в термостате при 37 С в течение 24 ч. Затем тщательно перемешивают содержимое пробирок, взвесь клеток центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин, супернатант сливают, а осадок суспендируют в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и измеряют величину абсорбции взвеси при 600 нм на спектрофотометре. Величина абсорбции (3) в пробирке 1 - 0 в контрольной пробирке 2 4,620,82 (что соответствует 15,4 млрд. микробных тел). Следовательно, рост госпитального штаммаподавлялся на 100 . Пример 2. Суспензию клеток - 100 млн. микробных тел в 60 мкл культуральной жидкости госпитального штамма псевдомонад 23/2 гоб 2 высевают в каждую из двух пробирок ( 1 и 2) с 10 мл мясо-пептонного бульона. В пробирку 1 вносят асептически водный раствор смеси лизоцима с этилендиаминтетраацетатом натрия в концентрации 50 мкг/мл и 10-3 М соответственно, а в пробирку 2 (контроль) - такой же объем стерильной дистиллированной воды. Закрывают пробирки ватно-марлевыми пробками. 15047 1 2011.10.30 Обе пробирки инкубируют в термостате при 37 С в течение 24 ч. Затем тщательно перемешивают содержимое пробирок, взвесь клеток центрифугируют 15 мин при 4000 об/мин, супернатант сливают, а осадок суспендируют в 1 мл изотонического раствора хлорида натрия и измеряют величину абсорбции взвеси при 600 нм на спектрофотометре. Величина абсорбции (3) в пробирке 1 - 0,030,01 (что соответствует 0,1 млрд. микробных тел) в контрольной пробирке 2 - 3,20,60 (что соответствует 10,67 млрд. микробных тел). Следовательно, рост госпитального штаммаподавлялся на 99 . Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ позволяет активно подавлять рост культур госпитальных штаммов псевдомонад, использовать доступный и безопасный для медицинского персонала и пациентов ингибитор, являющийся фармацевтическим препаратом. Данный способ может найти широкое применение при разработке рациональных путей борьбы с системной псевдомонадной инфекцией. Источники информации 1. Страчунский Л.С., Решедько Г.К., Стецюк О.У. и др. Сравнительная активность антисинегнойных антибиотиков в отношении нозокомиальных штаммов, выделенных в отделениях реанимации и интенсивной терапии России // Клин.,микробиол. и антимикроб. терапия. - 2003. - Т. 5. -1. -С. 35-46. 2..,.,..// . . . - 2007. - . 13. . 560-578. 3.,,. -, -// . . . - 2006. - . 12. - . 63-68. 4.,,,.12// . . . - 2001. - 39(6). - . 2072-2078. 5. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 15-е, перераб., испр., доп. - М. Новая Волна, 2005. - С. 961. 6. Машковский М.Д. Лекарственные средства. Изд. 15-е, перераб., испр., доп. - М. Новая Волна, 2005. - С. 753. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3