Cпособ получения человеческого эритропоэтина

трех клонов имеют полную длину. Эти кдНК клонируют в вектор экспрессии. трансформируют ими клетки вируса 50-40 обезьяны(клеточная линия 605-1). а также клетки яичника китайского хомячка (клеточная линия СНО). ЭПО, полученный из клеток СОЗ. является биологическими активными ЭПО йп что и л что. ЭПО, полученный из клеток СНО, также биологически активен п уйтго и бп что.кДНК-клон ЭПО имеет открытую рамкуциатором и терминатором из 20-30 нуклеотидов (М) вверх по направлению кодирующей области. Образец Е.со 11. трансформированный клонированным геном ЭПО. депонирован в Атепсап Туре Сипиге Сопестйол. Воск уше, Магуапо. под номером АТСС 40153.Основные этапы способа состоят в следующем, Выделение геномного клона человеческого ЭПО. с1. Человеческий ЭПО очищают до гомогенности из мочи пациентов. страдающих апластической анемией. Полное переваривание этого очищенного ЭПО трипсином протеазы дало фрагменты. которые разделяют высокоэффективной жидкостной хроматографией с обращенной фазой. подвергают секвенированию (см. табл.2 и 3). Две из аминокислотных последовательностей /а-Аэл-Рпе-Туг-Ма-Тггр-Ьуу и /а-ТугЗег-Аэл-Рпе-Ьеи-Аго. выбирают для конструирования олигонуклеотидных зондов.Олигонуклеотиды используют для скрининга человеческой геномной ДНК-библиотеки в векторе Сл 4 А.Фаг, гибридизирующий к 17 мег. отбирают распределяют на малые группы и гибридизуют с 14 мег и 18 мег пулами. Фаг,гибридизирующий к 17 мег, 18 мег и 14 мег пулам. очищают от пятен. а фрагменты субклонируют в векторы М 13 для секвенирования путем дидезокси-метода. и получают два клона Я. -НРО и Я. НЕРО 2.2. Выделение клонов кДНК ЭПО.Моплегл анализ сыворотки плода теленка (возраст 20 недель) печеночной мРНК осуществляют с использованием 95 п однонитиевого зонда. полученного из клона М 13. содержащего участок 87 Ьр экзона. описанного а табл.1. Далее мРНК ЭПО идентифицируют с использованием того же зонда для скрининга Я. ДНК библиотеки бактериофага мРНК сыворотки плода теленка. Несколько гибридизирующих клонов получают с частотой приблизительно 1 положительный на 250000 подвергнутых скринингу ре то3. Структура и последовательность гена ЭПО человека. Гибридизационный анализ этих клонированных ДНК при помощи олигонуклеотидных зондов и различных зондов позволил определить положение гена ЭПО внутри приблизительно 3.3 кБ области. Полный анализ секвенирования этой области и сравнение с клонами кДНК приводят к получению карты интронной и зкзонной структуры гена ЭПО. Ген ЭПО имеет 5 экзонов. Часть экзона 1, полные зкзоны . Н и / а также экзон / содержат кодирующую белок информацию. Оставшиеся части экзонов 1 и4, Неустойчивая экспрессия ЭПО в клетках СОЗ.Вектор р 9 1023/В/ содержит основной поздний промотор аденовируса. последовательность полиаденелирования 5 Ч 40. /40 начало репликации. ген-усилитель 3040 и ген /А аденовируса. ВставкукДНК из Я. НЕРОР 1.13 встраивают в вектор р 9102 З и получают рекомбинантную плззмидную ДНК рРТР - 1.13. Полученной ДНК трасфектируют штамм МВ клеток С 01. клетки промывают. переносят а среды. не содержащие сыворотку. клетки собирают через 48 ч. С использованием количественного радиоиммунного анализа исследуют уровень экспрессии ЭПО в культуральную надосадочную жидкость. Вектор. содержащий кДНК ЭПО из д. -НЕРОР 1.13. трансфектируют в клетки С 05-1. Наличие ЭПО в культуральной среде определяют с помощью Н-тримидин и СРЦ-Е методом или любым из двух анализов Ел уйуо. а именноски активный ЭПО продуцируется в клетках СО 5-1. Было установлено. что ЭПО. проду циоуемый клетками СО 5. имеет подвиж- .ность на ЗОЗ-полиакриламидном геле. которая идентична подвижности нативного ЭПО. полученного из человеческой мочи. Различные векторы. содержащие другие промоторы. также могут быть использованы в клетках СО или в других млекопитающих или зукариотических клетках. Примеры этих иных промоторов. кото рые МОГУТ бЫТЬ ИСПОПЬЗОВЗНЫ В ЗЗЯВПЕННОМспособе. включают ранние и поздние промоторы 5040, генный промотор металлотеоннина мыши. промотор. обнаруживаемый в длинных концевых повторах ретровирусовптиц или млекопитающих. полиэдральный генный промотор бакуловируса и другие. Примерами штаммов- реципиентов. которые могут использоваться в заявленноммлекопитающих. такие как СНО (яичник китайского хомячка) еС 127 (эпителий обезьяны), ЗТЗ (мышиный фибробласт). СЧ-1(почка африканской зеленой мартышки) и клетки насекомых такие как клетки от Зрооортега тгишрегоа и Вгозорлна теталооазтег. Эти промоторы и типы клеток могут обеспечить возможность регулирова ния уровня зкспрессииЭГЮ. 1Вирус ядерного полиэдроза имеет геном двунитевой кольцевой ДНК размером 128 кб. Нуклеокапсид вируса имеет палочковидную форму и находится упакованным вдвух формах. Эти вирусы могут быть обычным путем раэмножены в культуре клеток насекомых. Среды для культивирования этих клеток это обычно питательный солевой раствор и 10-я фатальная телячья сыворотка. п Итгот вирусный роствирус (НОВ) входит в клетку и продвигается к ядру. где-он реплицируется. Репликация является ядерной. В течение начальной фазы (8-18 ч постинфекции) вирусной аппликации нуклеокапсидьл собираются в ядре и впоследствии проходят через плазменнуюмембрану распространяя инфекцию покультуре клеток. Кроме того. некоторые нуклеокапсиды впоследствии (еще 18 ч постинфекции) остаются в ядре и закупориваются в белковой матрице, известной какполиздральное внутриклеточное включение (ПВВ). Эта форма не является инфекционной в культуре клеток. Матрица состоит из белка. известного как полиздрин. молекулярный вес 33 кд. Каждое ПВВ имеет приблизительно 1 мм в диаметре и в ядре могут быть до 100 ПВВ. Ясно. что большое количество полиэдрина продуцируется позже в цикле заражения и оно составляет до 25 общего количества клеточного белка.Так как ПВВ не играет роли в цикле репликации Еп упго. полиадриновый ген может быть убран из вирусной хромосомы без какого бы то ни было влияния на жизнеспособность п что При ьтспользовании вируса в качестве вектора экспрессии заменяют область. кодирующую полиэдриновьяй ген,чужеродной ДНК и помещают ее под контроль полиздринового промотора. Это приводит к вирусному фенотипу. не образующему ПВВ.у Описаны рекомбинантные плазмидные ДНК. содержащие ген ЭПО под контролем промотора вируса ядерного полиздроза. л В результате генетической рекомбинации происходит замещение области полиэдринового гена Азы РУС дезоксирибонуклеиновой кислотой из плазмиды. ф Рекомбинантный ЭПО. полученный в клетках СНО. очищают традиционными методами колоночной хроматографии. биологическую активность очищенного рекомбинантного ЭПО гл упго определяют известными методами (биопроба на пролиферацию клеток селезенки). у с Удельная активность п уйтго полученного и очищенного рекомбинантного ЭПО составила 200000 ед./мг- белка. Среднее значение находится в интервале 275000 тния выше чем 300000. Отношения активности Ял но к активности 111 что исследуемые для рекомбинантного ЭПО. равны 0.71.3. .Изобретение иллюстрируется следующими примерами.П р и м е р 1. ЭПО очищают от мочи пациентов. страдающих апластической анемией. известным методом за исключением того, что опускают фенольную обработку и заменяют термообработкой при 80 С в течение 5 мин для инактивации нейраминидааьл. Конечную стадию очистки проводят путем фракционирования на колонке С-4 /уас высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием от 0 до 95 ацетонитрильного градиента с 0,1 трифторуксусной кислоты (ТФК) а течение 100 мин. ПоложениеЭПО в градиенте определяют электрофорезом вгеле и анализомных пиков. ЭПО злюируют при 53 ацетонитрила и обнаруживают приблизительно 40, белка подвергаемого высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенной фазой. Фракции содержащие ЭПО. выпаривают до 100 мкл. доводят до рН. 7 бикарбоната аммония и обрабатывают 2 ым ТРЕК-обработанным трипсином в течение 18 ч при З 7 С. Полученные фрагментыподвергают ВЭЖХ с обращенной фазой. как описано выше. Хорошо отделенные пики вьнпаривают почти до сухости и подвергают НЕПОСРЕДСТВЕННО ЗНЭЛИЗУ М-КОНЦВВОЙ ЗМИ нокислотной последовательности. используя газофазный .секвениатор модели 4 В 0 А.денную в табл. 2 и 3. Два фрагмента. попученные в результате обработки трипсином. отбирают для синтеза олигонукпеотидньахзондов. Из последовательности /а-АзпРЬеТуг-Аа-ТгР-.уз получают 17 мег со следующей нуклеотидной последовательностью. А А А ТТССАМБССЭТАВААЭПи 18 мег со следующей нуклеотидной последовательностьюИз последовательности. ./а-Туг-ег-АзпРле-Ьец-Аго получают два пула 14-меров.ТТСЭ МТГ ТТС МТТ ТАСАСТААСТТССТ И ТАСА СТААСТТСТТзации. Приблизительно 120 сильных дупликатных сигналов обнаруживают вслед за 2-х дневной авторадиографией усиливающим экраном. Положительные сигналы отбирают. группируют в пулы из 8. пересевают и вновь подвергают скринингу с использованием 1/2 14 мег пула на каждом из двух фильтров и 127 мег на третьем фильтре. Условия высева и гибридизации при этом те же. но гибридизацию осуществляют при 37 С. Вслед за авторздиографией зонд с фильтра переносят в 50-ом формамиде в течение 20 мин при комнатной температуре и фильтр повторно гибридизируют при 52 С 18 мег зондом. Два независимых фага гиб ридизируют со всеми тремя зондами. ДНКОлигонуклеотиды метят в 5-конце 32 Р. ис 92 ользуя полинуклеотидную киназу и гаммаР-АТР. Удельная активность опигонуклео тидо варьирует между 1000 и 3000 дюйм /ммол олигонукпеотида. Геномную ДНК-библиотеку человека в бактериофаге лямбда подвергают скринингу. Приблизительно 3.5 х 10 фага высевают с плотностью 6000 фага на 150 мм чашку Петри со средой М 2 СУМ и инкубируют при 37 С до тех пор пока пятна не станут видными, однако маленькими (приблизительно 0.5 мм). После охлаждения при 4 С в течение 1 ч дупликатные реплики переносят на нейлоновые мембраны и инкубируют в течение ночи при 37 С на чашках со свежими средами МЕСУМ. Затем фильтры денатурируют и нейтрализуют в течение 10 мин каждого на тонкой пленке 0.5 Н МаОН-1 М МаСП и 0.5 М Тг 1(рН 8) - 1 М МаСГсоответственно. Вслед за вакуумной сушкой при 80 С втечение 2 ч фильтры промывают в 5 хБЗС. 05 505 в течение 1 ч и клеточные остатки на поверхности фильтров удаляют путем осторожного соскоба сухой тканью. Это соскаблиаание снижает фоновое связывание зонда с филь 25трами. Фильтры затем промывают водой ипредварительно гибридизируютот 4 до 8 ч при 48 С в ЗМ растворе тетраметипаммонийхлорида. 10 мМ МаРОд (РНБВ). 5 х Веппаготз. 0,5 05 и 10 мМ ЭДТК. 17 мег. меченый Р. затем прибавляют при концентрации 0.1 пмол/мл и гибридизацию осуществляют при 48 С в течение 72 ч. Вслед за гибридизацией фильтры промывают экстенсивно в 2 х ЗЗС (03 М МаС - 0.03 Мцитрат натрия, рН 7) при комнатной температуре и затем в течение 1 ч в ЗМ ТМАСР-ТО мМ МаРОА (рН 6.8) при комнатной температуре и от 5 до 15 мин при температуре гибридииз одного из этих фагов обозначают здесь Я.-НЕРО. переваривают рестриктазой аи 3 А и субконируют в М 13 для анализа ДН К-последовательности.П р и м е р 2. 5 мкг мРНК человеческой печени эмбриона и мРНК печени взрослогочеловека подвергают злектрофорезу в 0.8 -ом агарозном формапьдегидном геле и переносят на нитроцеллюлозу. Однонитевый зонд получают из матрицы М 13. содержащей вставку. показанную в табл.1. Праймером является 20 мег. происходящий из того же фрагмента. что и первоначальный 17 мег зонд. Получают зонд за исключением того. что вслед за расщеплением Эта малый фрагмент очищают от М 13 хроматографией на колонке с Сефарозой С 14 В и 0.1 М МаОН т 0.2 МА МаС. Фильтр гибридизируют приблизитепьнодо 5 х 105 отсчетов в минуту сП р и м е р 3. Зонд. идентичный описанному в примере 2. получают и используют для скрининга библиотеки кДНК печени змбриона. полученной в векторе А -СЬ 21 А.ИСПОЛЬЗУЯ стандартные МЕТОДИКИ СКрИНИН га бляшек. Три самостоятельных положительных клона обозначены здесь ЪНЕРОР 1.6 (1350 пар оснований). Я. НЕРОРЬВПОО п.о.)и ЪНЕРОР 1.13.0400 п.о.) выделяют вслед за скринингом 1 х 106 бляшек. Полную вставку Я. -НЕРОР 1.13 и Я. -НЕРОР 1.6 секвенируются вслед за субклонированием в М 13 (табл. 7 и 5 соответственно). Только часть вставки Я. -НЕРОР 1.8 секвенируют. ОстальныеЧфрагменты считают идентичными двумдругим клонам (табл.7). 5- и Знетранслируемьне последовательности представлены строчными буквами. Коди- рующая область представлена прописны ми буквами.В отношении табл.2 и З следует упомянуть. что определенная аминокислотная последовательность. показанная ниже нуклеотидной последовательности. пронумерована начиная с цифры 1 длятпервой аминокислоты созревшего белка. Остат ки цистеина. а .созревшем белке. дополнительно указаны 5 Н. и потенциаль 1 н.ыеМ-сайты гликолизирования обозначенызвездонкой. кдНК-клоны -НЕРОР 16. 11 НЕРОЕ 8 и ад. -НЕРОР ЦЗ задепонирова ны в А-тепсалТуре-Сипцге СонектйопРоску 1 еМагуало под номерами АТССП р и м е.р-4. Геномные клоны Я. -НЕРо 1. А -НЕРО 2. А -НЕРО 3 и А -НЕРОБ депонированы вАтеПсапТуре Ситпге Сопесиоп. Роскуше. Матгугало под номерами АТСС 40.154.АТСС 40155. АТСС 40.150 иу Используют вектор рАЦ 326 ЗА рАГ). эта плазмида- содержит кДНК-ген тдигидрофолятредуктазы мыши (ВРНР). который нахо дится под контролем позднего промотораяду поздним промотором аденовируса 2 ирАЦЭ 26 рА(3) превращают в Плазмиду рС/3 Л 12. рАЬО 2 б/5 рА(3) превращают в Плазмиду рАЬВ 26-5/рА(3) (Ь) делецией одного из двух сайтов Р-зт 1 в плазмиде рАЭ 26/рА (3) путем частичного переваривания Рзт 1 и получают субпопуляцию плаамид в которой только один сайт Рзт 1 расщеплен. затем осуществляют обработку илигирование ферментом Кленова. -.форезом в акриламидном геле фрагмент размером 140 пдо, Фрагмент 140 полигируют с плазмидой рАВ 2-6/ рА (3). обработанной с рестриктааой РуиН. Продукт лигирования используют для трансформации Е.со. колонии подвергают скринингу-старного к фрагменту из.14 О п.о.-ДНК получают из положительно тибридизирующихся колоний. 10.тем лигируютф обработанной рестриктазойХЬО плазмидой рТР и получают плазмиду рБУЗУЬ 2-ТРЬЦ Ориентация фрагмента Э 5 У 4 О в рСУУ 2-ТРЬ такова. что поздний промотор вируса 040 находится в такой жеориентации. что и основной поздний промотор аденовируса. . аудля интродудгирования генов /А в рСУЗУЬ 2 ТР 1 вначале конструируют плазмиду рВНЗ 22. которая содержит в НЕпШП ь сайте фрагмент В-аденовируса типа 2. ДНКфрагмент В выделяют электрофорезом в ге ле. Этот фрагмент встраивают в плазмиду рВК 322.т которая предварительно была обработана НйпсНП. После трансформации Е.со 1 отбираютгрекомбинанты и ориентировкудвстроенных фрагментов определяютФрагмент АуаПО вируса 5/4 О. содер- лжащего- последовательность энхансера 140. получают путем обработки ДНК-/40 ферментом-Ауап. фрагментом Кленова Ро 1 с- последующей лигацией Хло -1-линкеров. хны-фрагментом и выделением фрагмента электрофорезом в геле. Этот фрагмент за 55НйпсШЪВ обрабатывают Нра . добавляют линкерья Есот и гидролизуютЕсот. Фрагмент. имеющий липкиеконцьп Есот. встра ивают в ЕсоНЗ-саит плазмид-у РТ.гидролиэованной ЕсоГН. После трансформации штамма Е.соЬ 1 В 101 отбирают колонии. устойчивые к тетрациклину. далее на фильтрах колонии подвергают скринингуиадположительно гибридизирующих клонов и гидролизуют рестриктазами. Полученную Плазмиду обозначают р 91023. Плазмидуполучают два фрагмента одинноколо 7 кВ- и другой около 1.3 кВ. Последний фрагментсодержитгены УА. Концы обоих фрагментов заполняют с использованием фрагмента Кленова РоП и два.фрагмента затем лигируют один .к другому. Плазмиду р 9102 З/А/. содержащую гены /А. являющуюсяаналогичной плазмиде р 91023. однако потеряв шую два сайта Есот. идентифицируютд Один Ре д-сайт в плазмиде р 91023/А/ заменяют на Борт-сайт.- р 91023/А/гидролизуют рестриктазой Рзг и обрабатывают фрагментом Кленова Рои для восстановления .концов. ЕсоЮ-линкеры лигируют с тупым сайтом Рат ппазмиды р 91043/А/. Линейную Плазмиду .р 91 О 23/А/ с Есотлинкерами. присоединенными к тупым сайтам Рзт. отделяют от несшившихся линкерое и гидролизуют Есой рестриктазами. после чего повторно лигируют. Идентифицируют плазмиду р 91 О 23/В/. которая аналогична р 9102 З/А/но вместо прежнего сайта Рви. в ней содержится-сайт Есот.