Биологический способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты, штамм Penicillium chrysogenum PC100, ATCC 74182 – продуцент адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИЙ СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 7-АМИНОДЕЗАЦЕТОКСИЦЕФАЛОСПОРАНОВОЙ КИСЛОТЫ, ШТАММ 100,74182 - ПРОДУЦЕНТ АДИПОИЛ-7-АМИНОДЕЗАЦЕТОКСИЦЕФАЛОСПОРАНОВОЙ КИСЛОТЫ(72) Авторы Майкл Дж. КОНДЕР Лорили КРОФОРД Филлис К. МАКЭЙДА Джон А. РЭМБОУСЕК(57) 1. Биологический способ получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-), включающий следующие стадии а) культивирование штамма, который продуцирует изопенициллин , в культуральной среде, способной обеспечить его рост, и добавление в указанную культуральную среду адипатсодержащего сырья, содержащего адипиновую кислоту или одну или несколько ее солей и сложных эфиров,которые усваиваются и утилизируются указанным штаммомс продуцированием адипоил-6-аминопенициллановой кислоты (адипоил-6-АРА),причем штаммтрасформирован ДНК, кодирующей экспандазу, способную использовать в качестве субстрата адипоил-6-АРА, вследствие чего в результате ее экспрессии адипоил-6-АРА впоследствии подвергаетсярасширению цикла с образованием адипоил-7 б) взаимодействие адипоил-7-АСА с адипоилацилазой, посредством чего удаляется адипоильная боковая цепь, и образуется 7 в) выделение полученного продукта. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что адипат-содержащее сырье представляет собой адипат динатрия. 3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что ДНК, кодирующая экспандазу, происходит изАТСС 27064. 4. Способ по п. 1, отличающийся тем, что адипоилацилаза происходит из. 5. Способ по п. 1, отличающийся тем, что штаммтрансформирован рекомбинантным экспрессирующим ДНК-вектором, содержащим промотор генаи ДНК, кодирующую экспандазу, происходящую изАТСС 27064. 6. Штамм 100, АТСС 74182 - продуцент адипоил-7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (адипоил-7-АСА), трансформированный рекомбинантным экспрессирующим ДНК-вектором, содержащим ДНК, кодирующую экспандазу, происходящую изАТСС 27064, и промотор гена, управляющий экспрессией ДНК, кодирующей экспандазу, способную расширять пенициллиновую кольцевую структуру пенициллинас образованием цефалоспориновой кольцевой структуры дезацетоксицефалоспорина С. Изобретение относится к биологическим способам получения коммерческих цефалоспориновых антибиотиков, которых в настоящее время существует достаточное число, причем сейчас эти терапевтические средства представляют четвертое поколение. Признано, что большое разнообразие боковых цепей в коммерческих цефалоспоринах и существенная экономическая роль цефалоспоринов увеличивают значение разработки более экономичных и эффективных способов получения ключевых промежуточных соединений, которые позволяют легко синтезировать различные цефалоспорины. Одним из таких ключевых промежуточных соединений является 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота (7-), которая может быть изображена следующей формулой. Обычно 7- получают из пенициллина С, при этом требуется четыре или пять химических стадий,чтобы расширить систему пенициллинового кольца от 5-членного до 6-членного кольца, которое характеризует цефалоспорины. Этот способ, как полностью химический синтез, имеет серьезные недостатки. К их числу относятся необходимость многостадийного и комплексного процесса, высокая стоимость реагентов,проблемы обработки сточных вод, содержащих значительные количества побочных продуктов, образующихся в результате процесса, и очистка исходного материала перед началом химической обработки. Поэтому продолжаются поиски микробиологического или ферментативного процесса, который обеспечил бы расширение ферментативного кольца и отщепление боковой цепи с образованием 7- на более экономичной основе, чем химический способ, который используется сейчас. Соответственно настоящее изобретение касается области получения ключевого промежуточного соединения цефалоспорина 7-, и более конкретно - к области биопроцесса для получения 7-. Сначала поиски удачного биопроцесса для получения 7- были безуспешны, особенно с точки зрения коммерческого масштаба. Например, можно получить 6-аминопенициллиновую кислоту (6-АРА) прямой ферментацией и/или ферментативной обработкой пенициллина , после чего остается только необходимость расширения кольца, чтобы получить 7-. Однако найдено, что ферментыили , которые осуществляют расширение кольца при обычном обмене в этих микроорганизмах, не приемлют 6-АРА в качестве субстрата. Эти ферменты относят в технике кили экспандазе, и определяются как ферменты, которые катализируют расширение кольцевых структур пенама, обнаруженных в молекулах типа пенициллина, до цеф-3-ем-колец,найденных в цефалоспоринах. Далее здесь такие ферменты будут упоминаться как фермент экспандаза. Субстратом, на котором фермент экспандаза проявляет активность, является пенициллин , который при расширении кольца дает дезацетоксицефалоспорин С . В таком случае, чтобы получить 7-, необходимо только отщепить боковую аминоадипоиловую цепь, но эта боковая цепь оказывает упорное сопротивление ферментативному отщеплению, давая только неприемлемо низкие выходы. В соответствии с настоящим изобретением можно осуществить эффективный биопроцесс, в котором образуется соединение пенициллина, имеющее боковую адипоильную цепь, посредством нового способа ферментации с высокими титрами, причем упомянутое соединение пенициллина является приемлемым субстратом для ферментной системы экспандазы, которая образуетсятем же микроорганизмом, который образует соединение пенициллина, и которое трансформируется для экспрессии упомянутой системы фермента экспандазы. Экспандаза затем с высоким выходом расширяет кольцо соединения пенициллина до соединения цефалоспорина. И, что важно, боковая цепь соединения пенициллина, теперь соединения цефалоспорина, способна удаляться при действии другой ферментной системы с удивительно высоким выходом. Неожиданным результатом этого уникального биопроцесса, который составляет суть настоящего изобретения, является производство 7- с удивительно высоким выходом. 4382 1 Известен биопроцесс для получения 7- (см.., в Си. . 1990. 17213-221) посредством расширения кольца пенициллинас последующим ферментативным гидролизом получающегося в результате дезацэтоксицефалоспоринас образованием 7-. Такой способ основан на наличии клонированного пенициллиномгена экспандазыиз .(., . . 1989 171754-760, и патент США 5070020). Однако, так как экспандаза проявляет активность на пенициллине, своем природном субстрате, но не на пенициллине , способ требует приемов генной инженерии для получения модифицированного гена экспандазы, который может расширять кольцо пенициллина. Однако,., не добились требуемой модификации, и они только преуспели в трансформациис -геном изи экспрессии низкого уровня фермента(экспандазы). Фермент экспандаза хорошо изучен в технике как с точки зрения его активности, так и его последовательности. Например, в патентах США 4510246 и 4536476, , циклаза, эпимераза и ферменты расширения кольца выделены отдельно из бесклеточного экстракта прокариотных продуцирующих -лактам организмов включая, чтобы дать устойчивые ферментные реагенты. Заявка на Европейский патентЕР-А-О 366354 описывает очищенный фермент экспандазу, выделенный из., который отличается концевой группой и аминокислотным составом, и упоминается, что его молекулярная масса составляет около 34600 дальтон. Это, однако, находится в противоречии с молекулярной массой, равной 29000, приписываемой этому же ферменту в патенте США 4536476. Заявка на Европейский патентЕР-А-О 233715 раскрывает выделение и создание карты эндонуклеазного ограничения фермента экспандазы, полученной из . , трансформацию и экспрессию в хозяине упомянутого фермента, и примеры расширения кольца субстрата пенициллинас использованием упомянутого фермента. Патент США 5070020 раскрывает последовательность ДНК, кодирующую фермент экспандазу, полученную из . , и описывает трансформацию штамма .с вектором экспрессии,содержащим упомянутую последовательность ДНК, за счет чего получают экспрессию фермента экспандазы. Хотя предполагается, что этот фермент пригоден для экспансии субстратов и иных, чем пенициллин ,примеров такой экспансии не приводится. Описанная выше работа сосредоточивает внимание на ферменте экспандазе, полученной из прокариотного . . Этот же фермент или по крайней мере фермент, явно имеющий ту же активность по расширению кольца, также подвергается экспрессии штаммами эукариотного(также называемого). Однако в таких штаммах активность экспандазы экспрессируется бифункциональным геном , который также экспрессирует активность(гидроксилазы), естественной функцией которой является конверсия дезацетоксицефалоспорановой кислоты- продукта фермента экспандазы - в дезацетилцефалоспорин С . Результатом является один, но бифункциональный фермент - экспандаза/гидроксилаза. Хотя предприняты усилия по разделению активностей этих двугенных продуктов, успех пока не достигнут. Например, заявка на Европейский патентЕРО 281391 раскрывает выделение и идентификацию ДНК-последовательности гена /, полученного из С.АТСС 11550, вместе с соответствующими аминокислотными последовательностями ферментов.трансформируется и экспрассирует ферменты, однако попытки конверсии пецициллиновив соответствующие цефалоспорины нигде не демонстрируются. Кроме того, несмотря на предположение, что техника генной инженерии дает легкий способ разделения генетической информации, кодирующий ,и , и их раздельного выражения, фактических примеров такого разделения не приводится. Фермент / (экспандаза/гидроксилаза) из С. также хорошо изучен в технике как в отношении его активности, так и в отношении его свойств и генетической последовательности. Например, в патентах США 4178210, 4248966 и 4307192, , различные исходные материалы типа пенициллина обрабатывают бесклеточным экстрактом С. , который эпимеризует и экспандирует кольцо с образованием антибиотика типа цефалоспорина. -в патенте США 4753881 описывает фермент С.с точки зрения его свойств, таких как изоэлектрическая точка, молекулярная масса, аминокислотные остатки, соотношение активностей гидроксилазы и экспандазы и пептидные фрагменты. Прототипы, описанные выше, имеют сходство только с одним аспектом настоящего изобретения, т.е. с трансформацией штамма Р.геном, экспрессирующим фермент экспандазу, и получением экспрессии этого фермента. В технике, однако, используют экспрессированный фермент только для расширения кольца пенициллина , но не пенициллинови . Даже в этом случае пенициллинимеет боковую цепь в положении 7, которая не может быть отщеплена ферментативно с образованием 7-, как по способу настоящего изобретения. Настоящее изобретение основывается на поразительном открытии, что адипоильная боковая цепь может быть эффективно присоединена штаммом . , и что фермент экспандаза, экспрессированный, может эффективно использовать это соединение в качестве субстрата для расширения кольца до адипо 3 4382 1 ил-7-, и что адипоильная боковая цепь затем может быть эффективно удалена с помощью еще одного фермента с образованием 7-. Хотя отдельные выделанные фрагменты настоящего изобретения могут быть найдены в прототипах, нельзя предположить, что их можно соединить и получить непредвиденные результаты, которые получают по способу настоящего изобретения. Например, в технике известен способ получения 6-адипоилпенициллиновой кислоты, см. , .., (1960), 185, 97-99. Ферментативное расширение 6-адипоилпенициллиновой кислотытакже известно в технике, см.а 1.,(1987), 43, 3009-3014 иО 268343. Также известно и ферментативное отщепление боковых адипоильных цепей см.., (1987) 169, 5815-5820. Адипоильная боковая цепь имеет строение СООН-(СН 2)4-СО-, в то время как ближайшая родственная боковая цепь представляет собой глутарил и имеет строение СООН-(СН 2)3-СО-. Ферментативное отщепление боковых глутариловых цепей известно в технике, см., например,. . . (1981) 45,1561-1567, . . (1985), 163, 1222-1228., . . (1987), 169, 58155820 .53-086084 (1978 -. .) и .52-128293 (1977 . .). Кроме того, заявка ЕРА-А-О 453048 описывает способы улучшения отщепляющей адипоил активности глутарилацилазы, полученной с помощьюУ-77-1. При замещении различных аминокислот в некоторых местоположениях в пределах альфа-субъединицы наблюдают увеличение степени отщепления адипоила (из адипоилсерина) в три-пять раз. Следует отметить, что хотя заявкаЕР-А-0453048 и приводит примеры ацилазы с улучшенной активностью по отношению к адипоильным боковым цепям, но в ней не описаны какие-либо пути (ни химические, ни какие-либо биопроцессы, аналогичные описанным в настоящем описании), в соответствии с которыми на первой стадии можно генерировать адипоилцефалоспорин. В технике известно, что когда присутствует боковая аминоадипоильная цепь, в первую очередь-аминоацидоксидазой удаляют аминогруппу и укорачивают боковую цепь, оставляя боковую глутариловую (-7) цепь, и глутариловую боковую цепь удаляют другим ферментом (глутарилацилазой). Такое двухстадийное отщепление раскрывается, в патенте США 3960662, , в заявке на Европейский патент ЕР-А-О 275901 .61-218057 (1988 - ,.) ВОИС 90/12110(1990 - ,.) и., / (1991), 9, 188-191. Для того, чтобы облегчить лучшее понимание способа настоящего изобретения и изучения прототипов,описанных выше, ниже представлены различные стадии путей метаболизма, ведущие к пенициллинуи цефалоспорину С, промежуточным продуктам и ферментам, которые осуществляют трансформации. Настоящее изобретение относится к новому биопроцессу для получения 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-), который включает стадии 1) выдержки в культуральной среде, способной поддерживать его рост, штамма,который продуцирует изопенициллин , и добавления к упомянутой культуральной среде адипинатного сырья (питания), содержащего адипиновую кислоту или одну, или большее число, ее солей и эфиров, которые способны ассимилироваться и быть использованными упомянутым штаммомдля продуцирования адипоил-6-аминопенициллиновой кислоты (адипоил-6-АРА), в результате чего продуцируется упомянутая адипоил-6-АРА на этой стадии штаммтрансформируется ДНК, кодирующей фермент экспандазу, использующую адипоид-6-АРА в качестве субстрата, после чего продуцированная этим штаммом адипоил-6-АРА,расширяет кольцо с образованием адипоил-7-АСА и 2) приведения в контакт упомянутой адипоил-7-АСА с адипоилацилазой, посредством чего удаляется боковая адипоильная цепь и образуется продукт 7- и упомянутый продукт затем выделяют. 6 4382 1 Здесь используются термины, имеющие указанные далее значения. Адипоил-6-АРА означает 2-(2,5,6)-3,3-диметил-7-оксо-6-(гексан-1,6-диоил)амино-4-тиа-1 азабицикло-3.2.0 гептан-2-карбоновую кислоту и адипоил-7-АСА означает 7-(гексан-1,6-диоил) амино 3-метил-8-оксо-5-тиа-1-азабицикло- (4.2.0)окт-2-ен-2-карбоновую кислоту. В частности, настоящее изобретение относится к новому биопроцессу для получения 7 аминодезацетоксицефалоспориновой кислоты (7-), изложенному выше, в котором адипинатное сырье представляет собой динатрийадипинат, ДНК, кодирующая фермент экспандазу, получена изАТСС 27064, и для которого адипоилацелаза получена из вида . Настоящее изобретение относится также к вектору экспрессии рекомбинантной ДНК, содержащему ДНК,кодирующую фермент экспандазу, происходящую изАТСС 27064, и промотор, который стимулирует экспрессию этой ДНК, кодирующей экспандазу, включая плазмиду -, как описано далее. Настоящее изобретение, кроме того, относится к клетке-хозяину, трансформированного вектором экспрессии, содержащим рекомбинантную ДНК, кодирующую фермент экспандазу, происходящую изАТСС 27064, и промотор, который стимулирует экспрессию этой ДНК, кодирующей экспандазу, и содержащий промотор гена. В частности, настоящее изобретение относится к клетке -хозяину, трансформированного вектором экспрессии рекомбинантной ДНК, содержащим плазмиду , как описано далее. Настоящее изобретение относится также к способу, включающему стадию выращивания клетки-хозяина рекомбинантногов условиях, подходящих для генной экспрессии, при этом упомянутая клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, содержащий ДНК, кодирующую экспандазный фермент,происходящий изАТСС 27064, и промотор, который стимулирует экспрессию этой ДНК, кодирующей экспандазу, и содержащий промотор гена. В частности, настоящее изобретение относится к способу выращивания клетки-хозяина рекомбинантногов условиях, подходящих для экспрессии гена, при этом упомянутая клетка рекомбинантного хозяина включает вектор экспрессии рекомбинантной ДНК, содержащей плазмиду , как описано далее. Первым аспектом настоящего изобретения является новый биопроцесс для получения 7 аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-), ключевого промежуточного соединения при получении синтетических коммерческих цефалоспоринов, которая может быть представлена следующей структурной формулой. Помимо цефалоспоринового ядра отличительными чертами 7- являются группа 7-амино- и 3 метилгруппа. Группа 7-амино- является такой группой, которая может быть превращена в любые производные, которые образуют боковые цепи, и таким образом является основанием для синтеза различных коммерческих цефалоспоринов. 3-Метильная группа обычно, но не всегда - как в случае цефалексина - должна быть превращена в некоторую другую боковую цепь, чтобы синтезировать коммерческий цефалоспорин. 7- - продукт способа настоящего изобретения - может быть сопоставлена с цефалоспорином С еще одним ключевым промежуточным соединением цефалоспорина - который может быть изображен структурной формулой. Для такого промежуточного соединения для коммерческих цефалоспоринов может быть приемлема 3 ацетилоксиметильная боковая цепь. Однако 7 аминоадипоильная боковая цепь не приемлема для дальнейшего синтеза и должна быть отщеплена, чтобы дать приемлемую 7-аминогруппу. Однако 7 аминоадипоильная боковая цепь всегда отщепляется с большим трудом как химическими, так и биохимическими способами. В настоящем описании использованы некоторые термины, значения которых указаны далее. Синтетаза изопенициллинаТрис Трис гидроксиметил аминометан ЭДта Этилендиаминтетрауксусная кислота Диэтилпирокарбонат ТЕ Буфер Трис/ЭДТА Додецилсульфат натрия ПЭГ Полиэтиленгликоль КультураПервая стадия способа настоящего изобретения представляет собой стадию выдержки в культуральной среде, способной поддерживать его рост, штамма, который продуцирует изопенициллин , и стадию добавления к упомянутой культуральной среде адипинатного сырья, содержащего адипиновую кислоту или ее соли и эфиры. Адипинатное сырье может быть добавлено к культуральной среде после инокуляции Р. , но предпочтительно, чтобы оно уже присутствовало в культуральной среде в то время, когда происходит инокуляция. Адипиновая кислота или ее соли и эфиры имеют свойство ассимилироваться и использоваться упомянутым штаммом .для образования адипоил-6-АРА при этом упомянутый штамм .трансформирован ДНК, кодирующей активность экспандазного фермента, после чего, в результате ее экспрессии, упомянутая адипоил-6-АРАявляется расширяющей кольцо и образует адипоил-7-АСА. Другие виды рода , кроме вида , продуцируют изопенициллин . Однако исторически все штаммы самого высокого продуцирования изопенициллинаразрабатывались с помощью хорошо известных технических приемов улучшения штамма из вида . При существующей практике настоящее изобретение ограничено штаммами, хотя его применимость к другим видам очевидна. Любой депозитный штаммили из другого доступного источника такого штамма является подходящим отправным моментом для осуществления способа настоящего изобретения. Культуральная среда, способная поддерживать рост штамма, который продуцирует изопенициллин , имеет тип, который был бы удобен в обращении для специалиста. Например, выращивание может выполняться по способу глубинной аэробной ферментации, и используемая среда будет выбираться из числа доступных подходящих сред. Типичная среда использует источники углерода, такие как сахароза, глюкоза и крахмал источники азота, такие как соевая мука и овсяная мука, хлопковое масло, арахисовая мука и различные аминокислоты, их смеси, и пептоны. Требования производства придают особое значение выходу и легкости выделения, и, таким образом, предпочтительными средами в такой ситуации могут быть меласса, как источник углерода, и соевая мука и аминокислоты в качестве источника азота. К культуральной среде обычно добавляются питательные неорганические соли, и такие соли включают соли, способные дать следующие ионные компоненты натрий, калий, аммоний, кальций, фосфат, сульфат,хлор-ион, бром-ион, нитрат, карбонат, железо двухвалентное, железо трехвалентное, магний, марганец и т.п. Микроэлементы обычно также существенны для роста, развития и метаболизмаи могут быть добавлены непосредственно в культуральную среду, если они не введены уже в качестве примесей, по существу, с другими ингредиентами культуральной среды. Штаммымогут быть получены в оборудовании небольшого объема, таком как встряхиваемые колбы емкостью 1 л, в таком оборудовании желательно получать только небольшие количества 7-. Когда нужно получить большие количества адипоил-7-АСА, тогда необходимо использовать ферментеры большого размера в условиях глубинной аэробной ферментации. При осуществлении крупномасштабного получения адипоил-7-АСА спорыхранят на косячках агара. Споры с агара используют для инокулирования вегетационной среды небольшого объема. Вегетационную среду инкубируют и получают обильную, свежую, активно растущую культуру микроорганизма. Эту вегетативную поросль затем используют в качестве инокулянта для ферментационной среды большого масштаба. В некоторых случаях желательно включить еще одну, следующую, вегетационную среду в качестве инокулянта для ферментационной среды. Такую вегетационную среду второй фазы обычно используют тогда, когда объем ферментационной среды значительно больше объема первой вегетационной среды. В таком случае споры микроорганизма сначала выращивают в небольшом объеме вегетационной среды, чтобы получить инокулянт для вегетационной среды большего объема. В вегетационной среде боль 8 4382 1 шего объема концентрация микроорганизмов становится достаточной, чтобы инициировать быстрое начало ферментации в ферментере большого размера. Вегетационная среда может иметь тот же состав, что и ферментационная среда, или она может содержать дополнительные ингредиенты для стимулирования роста и развития микроорганизма в небольшом объеме. Штаммы, используемые в способе настоящего изобретения, наиболее эффективно выращиваются при температуре от 20 до 30 С, но оптимальный выход будет получен при температурах между 22 и 28 С, предпочтительно - при 25 С. Максимальное образование адипоил-7-АСА имеет место тогда, когда штаммвыращивают в больших резервуарах в течение 10-30 суток, предпочтительно - в течение 15-25 суток. Однако, когда выращивание осуществляют в небольшой аппаратуре, такой как встряхиваемые колбы емкостью 250 мл, рост микроорганизма происходит быстрее, и он образует адипоил-7-АСА за более короткое время,например за 4-15 суток, чаще - за 5-7 суток. Если конечная величина рН в ферментерах большого объема достигает 8,0 или выше, это может неблагоприятно воздействовать на выход адипоил-7-. В таких случаях желательно контролировать величину рН в процессе ферментации. Оказывается, что рН достигает такого уровня раньше времени максимального образования адипоил-7-АСА, и рН может быть снижена добавлением в ферментационную среду подходящей кислоты или буферного вещества. Образование адипоил-7-АСА может быть отслежено хроматографической проверкой образцов ферментационной среды. При осуществлении глубинной аэробной ферментации через культуральную среду пропускают стерильный воздух, чтобы получить более эффективный рост штаммаи увеличенное образование адипоил-7-АСА. Объем воздуха, пропускаемого через культуральную среду, обычно составляет приблизительно 0,2 объема в минуту на объем культуральной среды. Увеличение скорости пропускания воздуха часто может оказать благоприятное влияние на получение адипоил-7-. Штамм, как правило, помимо адипоил-7- будет продуцировать много побочных продуктов и метаболитов. Так как некоторые из них являются неустойчивыми кислотами, желательно при извлечении адипоил-7-АСА из ферментационной среды обрабатывать весь ферментационный бульон до кислой рН на короткое время, чтобы разрушить некоторые из образовавшихся примесей. Адипоил-7 АСА - продукт ферментации - извлекают из фильтрованного обработанного таким образом ферментационного бульона, и затем необязательно отделяют от других компонентов ферментационной среды хроматографией на ионообменной смоле, и далее возможна хроматографическая очистка, если необходимо, перед следующей стадией ферментного отщепления адипоильной боковой цепи. Можно осуществить такое ионнообменное хроматографическое разделение после того, как осуществят отщепление боковой цепи. Одним из наиболее важных побочных продуктов, который создает проблему при разделении, является адипоил 6-АРА, и чтобы сделать разделение более легким, можно разрушить этот побочный продукт химически или ферментативно. Сначала отфильтрованный ферментационный бульон подвергают предварительной очистке,которая может включать экстракцию сначала несмешивающимся с водой органическим растворителем, таким как н-бутанол или амилацетат, чтобы удалить примеси. Экстрагированный бульон затем может быть очищен далее, предварительно, хроматографией над активированным углем. Добавление адипинатного сырья Предпочтительно во время ферментативного выращивания, как описано выше,т.е. перед инокуляцией, добавлять к другим ингредиентам ферментативной среды для выращивания адипинатное сырье. Необязательно, но адипинатное сырье может быть добавлено в течение некоторого времени после инокуляции, например в 1, 2 и/или 3 день после инокуляции. Адипинатное сырье представляет собой адипиновую кислоту или одну, или большее число, солей или эфиров адипиновой кислоты, которые способны ассимилироваться и использоваться штаммом, который выращивают для продуцирования адипоил-7-АРА. Адипиновая кислота, соли и эфиры могут использоваться по одному или в любом сочетании. Предпочтительна динатриевая соль, хотя подходящими является также соли калия и смешанные соли натрия. Может быть использован метиловый эфир, этиловый эфир является водонерастворимым. Соль или эфир адипиновой кислоты должны быть такими, чтобы они могли быть ассимилированы и утилизованы штаммомдля получения адипоил-6-АРА. Например, сама адипиновая кислота может быть подходящей, хотя она не растворяется в воде, если при подходящей величине рН образуется способная ассимилироваться соль. Подходящие ферменты экспандазы Штамм, который выращен и обеспечен адипинатным сырьем, как описано выше,так что он продуцирует адипоил-6-АРА, является также штаммом, который трансформирован ДНК, кодирующей активность фермента экспандазы, после чего, как результат экспрессии, упомянутая адипоил-6-АРАрасширяет кольцо с образованием адипоил-7-АСА. 4382 1 Адипоил продуцируется внутриклеточно выращенным с адипинатным сырьем. В таком внутриклеточном состоянии, т.е., трансформированныйтакже экспрессирует ДНК, кодирующую активность фермента экспандазы, после чего фермент действует на адипоил как субстрат и расширяет ее кольцо с образованием адипоил-7-АСА. Новый биопроцесс настоящего изобретения включает в свой объем трансформацию штаммаописанного выше типа с любой ДНК, кодирующей активность фермента экспандазы, после чего, как результат экспрессии, адипоил-6-АРАрасширяет кольцо с образованием адипоил-7-АСА. Таким образом, ДНК, с которой трансформируетсядолжна выражать фермент, обладающий не только активностью фермента экспандазы, как это понимается в технике, т.е., способностью расширять кольцо изопенициллинадо , но способностью расширять кольцо адипоил-6-АРА до адипоил-7-. Однако на основании подобия боковых цепей ожидается, что любой фермент экспандазы будет способен работать в новом биопроцессе настоящего изобретения. В разделе описания прототипов уже отмечалось, что фермент экспандазы, происходящий изАТСС 27064, имеет полностью известную последовательность, как и карту эндонуклеазной рестрикции. Однако, как оказалось, тот же фермент, полученный из .3585, как сообщается,имеет другую молекулярную массу, но последовательность не представлена. Эти ферменты экспандазы, уже идентифицированные в технике, являются пригодными для нового биопроцесса настоящего изобретения. Другие еще неидентифицированные ферменты экспандазы, происходящие из других штаммов .или даже из микроорганизмов других родов, также могут оказаться подходящими для осуществления нового биопроцесса настоящего изобретения. Процедуры идентификации таких новых штаммов и родов пригодных микроорганизмов, как и выделения предполагаемых ферментов экспандазы, и подтверждения, что они являются подходящими для применения в способе настоящего изобретения, являются простыми и доступными для специалистов. Скрининг бесклеточных экстрактов кандидатов в новые штаммы и родов пригодных микроорганизмов может быть сделан надежным и воспроизводимым способом путем добавления упомянутых экстрактов к субстрату адипоил-6-АРА в присутствии известных кофакторов , которые включают ионы железа (2 ), аскорбат, -кетоглутарат и аденозинтрифосфат (АТФ). Субстрат адипоил-6-АРА может быть получен в достаточных количествах при питании адипинатным сырьем нетрансформированногопо способу, аналогичному способу, подробно описанному далее. Нужный экспандазный фермент присутствует, если образуется адалоил-7, присутствие которой может быть установлено методом хроматографии. Также возможно, используя хорошо известные приемы рекомбинантной техники, генерировать пробы ДНК, основанных на последовательности экспандазы .и С. , например, чтобы выделять ДНК-содержимое предполагаемых для применения микроорганизмов, подходящих для продуцирования экспандазы, подходящей для использования в способе настоящего изобретения. Потенциальные источники ферментов экспандазы Ферменты экспандазы, как уже отмечалось, представляют собой ферменты, которые катализируют расширение пенамного кольца, обнаруженного в молекулах типа пенициллина, до цеф-3-ем-колец, которые обнаружены в цефалоспоринах. Любой организм, продуцирующий метаболиты, которые содержат цефемное кольцо, является, следовательно, потенциальным источником ДНК, кодирующей экспандазу. Примеры таких организмов приведены ниже, но этот список представлен только для примера, и не должен рассматриваться как исчерпывающий. Грибы..Другие бактерии.Экспандазы организмов, перечисленных выше, являются только кандидатами для дальнейших исследований, и может оказаться, что не все они будут подходящими для нового способа настоящего изобретения. Например, применение таких ферментов, которые обладают как активностью экспандазы, так и активностью гидроксилазы, таких как ферменты из С. , могут в результате синтеза дать гидроксилированную адипоил-7-АСА, т.е.с адипоильной боковой цепью. Выделение фрагментов ДНК, кодирующих активность экспандазы Сразу же, как только установлено присутствие нужного фермента экспандазы по способу, описанному выше, выясняется, какие методики - простые и хорошо известные в технике - нужны для выделения ДНК,кодирующей активность фермента экспандазы. Конструируют пробы ДНК на основе известных последовательностей и неполных последовательностей генов, кодирующих ферменты экспандазы, которые будут гибридизироваться в низкий кодирующей фермент ДНК, которую выделяют. Составление таких проб основано на знании последовательности аминокислот и нуклеотидных оснований, кодирующей фермент экспандазы,так же, как и предпочтительных кодонов конкретного микроорганизма. Подробное описание типичной процедуры такого типа, используемой для геномной ДНКАТСС 27064, представлено далее. Выделение ДНК, кодирующей активность фермента экспандазы, сопровождается применением методик рестрикции и лигирования, хорошо известных в технологии рекомбинантной ДНК. Необходимо иметь карту эндонуклеазной рестрикции генома микроорганизма, чтобы можно было получить и выделить подходящий рестрикционный фрагмент. Рестрикционные карты для .и С.уже доступны, так, в первом случае используют рестрикционные ферментыи, и электрофорез обеспечивает фрагменты нужного размера - 1,8-2,2 к. Трансформация штаммаКак только получены фрагменты ДНК, кодирующие активность экспандазы, они могут быть вставлены(лигированы) в плазмиду или в другой вектор экспрессии вместе с фрагментами ДНК, включающими промоторы, трансляционные активирующие последовательности, маркеры устойчивости, регуляторные последовательности, элементы космид и любые другие последовательности ДНК, которые делают возможной или способствуют трансформации, стимулируют экспрессию генного продукта, и облегчают выделение трансформантов. Вектор экспрессии, который составлен таким образом, затем используют для достижения трансформации штаммаи внутримолекулярной экспрессии активности фермента экспандазы. Технические приемы для достижения трансформации и экспрессии хорошо известны в технике, и подробное описание таких типичных процедур приводится далее. Как уже подробно отмечалось выше, штамм трансформированногоэкспрессирует фермент экспандазу внутриклеточно, который затем действуетна адипоил-6-АРА-субстрат и расширяет ее кольцо до адипоил-7-АСА. Новый трансформант Специфический трансформант, экспрессирующий ген экспандазы, который представляет собой предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения, является новым относительно таких конструкций, существущих в технике, как конструкция, описанная ва 1. (1990), 17, 213-221. В обеих конструкциях для связывания промотора с геном экспандазы используют мутагенез. В конструкцииманипуляция вводит сайтвгена экспандазы, который лигируют в сайтв окончании 3 промоторалинкером /. В конструкции настоящего изобретения сайт 1 создается вгена экспандазы и лигируется в сайтв окончании 3 линкера . Это создает в таких конструкциях в местах соединения промотора и гена приведенные далее последовательности. Конструкциязамещает С на Т, в то время как в конструкции настоящего изобретения С сохраняется таким образом, последовательность промотора , непосредственно примыкающая к исходному кодону , точно подходит под пару к той, которая встречается с геноместественного происхождения. Возможно, что промотор прототипа, хотя он отличается только одним нуклеотидным основанием, может привести к более низкой эффективности трансляции и в результате к более низкому уровню экспрессии гена экспандазы. Другие отличия заключаются в участках промотора или гена, включенных в конструкции. Конструкциясодержит участок промотора 5 - 3, в то время как вектор настоящего изобретения содержит участок промотора 5-3 (,а 1., (1990) . .265, 16358-16365). Это дает в результате дополнительные 250 на окончании 5 промоторав конструкции . Однако этот участок находится в открытом считываемом остове гена синтетазы(в направлении 3-5) выше гена. Конструкциятакже содержит генотсайта 3 гена, в то время как вектор настоящего изобретения содержитдо сайта 3 гена (а 1 (1989), . ., 171,754-760). Это дает в результате приблизительно 1000 , дополняющих окончание 3 в конструкции . Конструкция настоящего изобретения содержит еще участок гена экспандазы, расположенный выше,до сайта 5 однако он отделяется от считываемого остова гена экспандазы промотором . Еще одно отличие построения настоящего изобретения от описанного в прототипе относится к избирательной способности маркера, который используется. Применение слияния промоторас флеомицином в конструкции настоящего изобретения ведет к выбору в пользу интеграции размножающихся копий или в пользу интеграции в локусах, что обеспечивает высокий уровень экспрессии, и таким образом,потенциально может дать более высокий процент трансформантов, которые экспрессируют ген экспандазы на высоком уровне. Новый трансформант описанного выше типа представляет собой, идентифицированный как РС. Его таксономические характеристики обычно включают продуцирование широко разрастающихся колоний, от сине-зеленого до зеленого цвета, однородной бархатистости с желтыми вкраплениями обратную диффузию желтого в агар конидиальные головки, ветвящиеся по всем частям гладкой поверхности эллиптические конидии длиной 3-4 мм. Приемлемые условия выращивания для .предполагают использование твердой среды, содержащей моногидрат лактозы -1,5(вес/объем) экстракт замоченной кукурузы - 0,5(вес/объем) пептон -0,5(вес/объем)- 0,4(вес/объем) 472- 0,55(вес/объем) КН 24 - 0,06(вес/объем) еС 36 Н 2 - 0,0005(вес/объем) 452 0,0002(вес/объем) агар - 0,3(вес/объем), в одном литре дистиллированной воды, рН 4,8. . , только что описанный и обозначенный РС, депонирован, 12301, ,20852, под регистрационным номером 74182 (дата депозита получен 21 августа 1992, и жизнеспособность проверена 27 августа 1992). Отщепление адипоильнои боковой цепи Следующая стадия нового биопроцесса настоящего изобретения заключается в отщеплении адипоильнои боковой цепи адипоил-7-АСА, что требует обработки продукта предшествующей стадии системой с ферментом адипоилацилазой. Как уже отмечалось выше, одним из существенных преимуществ настоящего изобретения является способность выполнять все стадии, ведущие к образованию адипоил-7-АВСА, в одном процессе ферментации. Это достижение дает исключительно возросшую эффективность ввиду отсутствия выделения и частичной очистки промежуточных продуктов при переходе от одной к другой стадии процесса. Однако на этой последней стадии не присутствует фермент адипоилацелазы, т.е. не генерируетсяв первоначальной ферментативной культуре. Если новый биопроцесс настоящего изобретения выполняют по периодической схеме, тогда необходимо выделять и частично очищать продукт первой стадии, и предварительные процедуры для этого уже описаны выше. Тем не менее способ настоящего изобретения может быть осуществлен любым путем, который эффективно дает контакт адипоилацилазы и адипоил-7-АСА таким образом, чтобы могла произойти ферментативная конверсия этого соединения до 7-. Таково определение термина контакт в его широком смысле. Можно использовать бесклеточный бульон сырой адипоил-7-АСА в качестве загрузки и обрабаты 12 4382 1 вать его по периодическому способу бульоном сырой адипоилацилазы. Такое приближение обеспечивает некоторую эффективность, поскольку не требует какой-либо существенной первоначальной очистки реагентов. Конечно, возможны модификации. Например, реагенты могут быть очищены до любой желательной степени, прежде чем будут приведены в контакт друг с другом. Также лучше было бы осуществлять процесс непрерывным способом, а не периодическим. Контактирование самих реагентов может быть модифицировано различными путями при сохранении улучшений в технологическом процессе. Так, может быть использован неподвижный фермент, например, в виде колонки, содержащей адипоилацилазу, причем адипоил-7 АСА пропускают через колонку. Неподвижный фермент также может быть добавлен к раствору адипоил-7 АСА в виде суспензии. Такие неподвижные ферментные системы дают преимущества, заключающиеся в легкости удаления фермента и многократном использовании. Другим примером такого технологического процесса является процесс, имеющий отношение к мембранным реакторам. Предпочтительным способом приведения реагентов в контакт является способ с применением колонок с ферментом. Ферменты адипоилацилазы, пригодные для стадии отщепления Существует ряд ферментов с известной специфичностью к адипоильным боковым цепям. Результаты,полученные с адипоилацилазой, доступной коммерчески от., подробно описаны далее в рабочих примерах. В литературе сообщается о семи других ферментах, которые удаляют адипоильные боковые цепи из молекул типа цефалоспорина. Шесть из этих семи ферментов представляют собой вид , и седьмой является видом . Между определенными ферментамисуществует некоторое подобие, но все семь различаются до некоторой степени по своим физико-биологическим свойствам. Некоторые характеристики этих ферментов приведены ниже. Фермент ( и Ссылка Приблизит. мол. массаштаммы)( .) 54,000., . . . (1991) 72 232-243.., . . (1991) 173 7848-7855. Все вышеупомянутые ферменты адипоилацилазы являются применимыми в новом биологическом процессе настоящего изобретения. Другие адипоилацилазы, пригодные для способа настоящего изобретения,могут быть легко обнаружены при испытании предполагаемых подходящих ферментов против адипоил-7 АСА, фактического субстрата, на котором они должны работать. Положительный результат является надежным и воспроизводимым способом определения того, что фермент-кандидат пригоден для способа настоящего изобретения. Субстрат может быть получен простым способом при реакции ангидрида адипиновой кислоты с 7-, для чего используется модификация методики, изложенной в, . .(1978) 84, 19-26. Ангидрид адипиновой кислоты может быть получен в соответствии со способом, описанным в . . . . (1990) 27, 397-412. 7 доступна из некоторых коммерческих источников, включая , .,и. . Если необходимо выполнить грубый скрининг ферментов-кандидатов с использованием экспрессколориметрии, субстрат адипоил-7-АСА можно заменить колориметрическим субстратом, таким как адипоил-РАВА (п-аминобензойная кислота) или адипоил- (п-нитроанилин). Отщепление боковой цепи дает вид, генерирующий окраску, и присутствие такого вида и концентрация легко определяются колориметром. Более подробная информация об этих и других подходящих колориметрических способах дается в Маге, (1968) . . . 572172-2173 , . (1969) . . 15124-136 , .,. (1980) . 4382 1 Сравнивают -концевые аминокислотные последовательности ферментас большими субединицамии 16 ферментов, приведенных выше в таблице. Результаты сравнения даются ниже (где круглые скобки указывают меньшую, чем окончательная, принадлежность). Из представленных последовательностей очевидно, что все три пептида являются родственными. Однако белок, имеющий -концевую последовательность, подобную показанным выше, не обязательно обладает адипоилацилазной активностью, как Е случае ацилазы пенициллина , продуцированной штампом . С другой стороны, существуют адипоилацилазы, пригодные для способа настоящего изобретения, которые не показывают достаточной гомологии к вышеупомянутой -концевой последовательности. Например, показано, что ферменти ацилазаВ.1, упомянутые в приведенной выше таблице, которые обладают некоторой активностью адипоил-7-АСА-ацилазы, не являются частью гомологии последовательностей других ферментов, упомянутых выше. Поэтому объем настоящего изобретения в отношении адипоилацилаз, пригодных для второй стадии нового биопроцесса, определяется тем, способен или нет кандидат-фермент отщеплять боковую адипоильную цепь от адипоил-7-АСА, свойство, которое может быть легко и надежно определено, как подробно описано выше. Возможны другие подходы к поиску подходящих адипоилацилаз. Например, заявка на Европейский патент ЕРА-А-О 453048 описывает способы улучшения активности отщепления адипоила глутарилацилазы,продуцированной-77-1. При замещении различных аминокислот в некоторых местах в пределах альфа-субъединицы наблюдают увеличение скорости отщепления адипоила (от адипоилсерина) в трипять раз. Такие улучшенные ферменты также были бы подходящими для применения в настоящем изобретении. Следует отметить, что хотя заявка ЕР-А-0453048 очевидно демонстрирует ацилазу с улучшенной активностью по отношению к адипоильным боковым цепям, в ней не описано каких-либо путей (ни химических,ни биопроцесса, в чем-либо аналогичного настоящему описанию), которыми можно, в первую очередь, генерировать адипоилцефалоспорин. Описание предпочтительных вариантов изобретения Далее приводится подробное описание некоторых предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения, но эти варианты представляют только иллюстрации, и никоим образом не являются ограничениями настоящего изобретения. Пример 1. Условия выращиванияШтамм, применяемый в этих методиках, хранят на пластинах, содержащих среду, составленную из моногидрата лактозы - 1,5(вес/объем) экстракта вымоченной кукурузы - 0,5(вес/объем) в одном литре дистиллированной воды, рН 4,8. После выдержки в течение 12 суток при 25 С и относительной влажности 65 единичные колонии удаляют и помещают в 2 мл стерилизованной воды в пробирки с винтовой верхней частью, содержащие стеклянные шарики. После мацерации поросли культуры путем вращательных движений суспензию используют для инокуляции в склянки с рисом. Склянки с рисом содержат в 250 мл своего объема 25 г конвертированного риса, натуральное длинное зерно которого промыто тремя-четырьмя объемами дистиллированной воды в течение семи минут, при перемешивании каждые 30 секунд, и затем высушено до содержания воды в рисе приблизительно 25 . После 12-дневной выдержки при 25 С и относительной влажности 65 споры вымывают из риса 50 мл стерильной воды. Суспензию спор используют для инокуляции культуры в жидкую среду и также для заготовки лиофилов культуры, хранящихся при 4 С. Споры добавляют в равный объем 5 сливок и лиофилизуют в стерильных ампулах. Используют двухстадийную ферментацию во встряхиваемых колбах для получения пенициллинов или для продуцирования мицелия, как источников РНК или ДНК. Стадию посева начинают добавлением 1108 спор в 500 мл колбу с 50 мл среды, составленной из глюкозы - 3,0(вес/объем)- 1,0(вес/объем) экстракта замоченной кукурузы -3,0(объемн.) сульфата аммония - 0,2(вес/объем) СаСО 3 - 0,5(вес/объем) безводного монокалийфосфата - 0,05(вес/объем) лактозы - 1(вес/объем) первичных сухих дрожжей - 1,0(вес/объем) в одном литре дистиллированной воды. Инкубацию осуществляют при 25 С и относительной влажности 65 на круговой качалке с диаметром размаха 70 мм при 220 об/мин. После 48-часовой инкубации начинают стадию продуцирования путем переноса 2 мл вегетационно 14 4382 1 го посевного материала в 500 мл колбу с 35 мл среды следующего состава КН 2 Р 4 - 0,05(вес/объем) 24 - 0,5(вес/объем) (4)24 - 1,0(вес/объем) лактоза - 12,0(вес/объем)2,75(вес/объем) СаСО 3 (осажденный) - 1,0(вес/объем) свиное сало - 1,0(объемн.) содержатся в одном литре дистиллированной воды, рН 6,6. После обработки в автоклаве, но до инокуляции, добавляют стерильный 25 адипинат натрия (рН 6,6) и получают окончательную концентрацию адипината натрия 2,5 . Инкубацию, а затем инокуляцию проводят в тех же условиях, что и на стадии посева, в течение 5-7 дней. Пример 2. Выделение геномной ДНКи общей ДНК Вегетационную мицелиальную поросль из 48-часовой культуры, полученной как описано выше, собирают фильтрацией через марлю, замораживают в жидком азоте и лиофилизуют в течение ночи. Высушенный мицелий измельчают с песком пестиком в ступке и снова суспендируют в 25 мл 100 мМ , 50 мМ ЭДТА,10 мМ Трие - рН 8,0, 4. После нагревания суспензии до 50-55 С на водяной бане (60 С) смесь экстрагируют сначала 1 М Трис (рН 8), насыщенным фенолом, затем смесью фенола с хлороформом (11 по объему), насыщенной трис, и затем хлороформом. РНК осаждают из водной фазы добавлением равного объема холодного 6 Ми затем оставляют смесь на два-три часа при -20 С. После центрифугирования при 12000 в течение 20 минут при 4 С супернатант делают 66(объемн.) этанолом и охлаждают до 20 С в течение 15 минут, чтобы осадить ДНК. После центрифугирования, описанного выше, осадок ДНК промывают 70 этанолом, сушат и снова суспендируют в буфере ТЕ (10 мМ Трис-, рН 7,5,мМ ЭДТА). Концентрацию ДНК оценивают путем сравнения с известными ДНК-стандартами при окрашивании бромэтидом при электрофорезе в агарозном студне. Культуры, описанные выше в примере 1, выращивают в течение 96 часов в 35 мл ферментативной среды (условия ферментации описаны ранее), при 25 С на круговой качалке при 220 об/мин. Мицелий собирают фильтрацией через фильтрпри пониженном давлении и промывают приблизительно 50 мл воды. Мицелий сразу же соскабливают с фильтра, снова суспендируют в 5 мл расслаивающего буфера ( ) 50 мМ Трис- рН 7,4, 150 мМ , 5 мМ ЭДТА рН 8,0, 5, замораживают в жидком азоте и лиофилизуют. После лиофилизации в течение ночи добавляют 5 мл воды, содержащей 0,1, и 5 мл М Трис (рН 8) насыщенного смесью фенолхлороформ (изоамиловый спирт) (50501), и смесь оставляют таять при 37 С в течение 20 минут при встряхивании. Смесь центрифугируют при 12000 хв течение десяти минут при 4 С, водный слой удаляют и вновь экстрагируют сначала М Трис (рН 8), насыщенным смесью фенолхлороформ (изоамиловый спирт) (50501), и затем М Трис (рН 8), насыщенным фенолом, и в третью очередь -хлороформом. С конечным водным слоем соединяют равный объем 6 М , и раствор оставляют при -20 С минимум на четыре часа. Общую РНК осаждают центрифугированием при 12000 хв течение 20 минут при 4 С, осадок растворяют в 0,3 мл ТЕ буфера с 0,03 мл ЗМ ацетата натрия и добавляют 2,5 объема этанола, чтобы снова осадить РНК. Конечный осадок растворяют в 0,1 мл буфера ТЕ, и концентрацию РНК определяют спектрофотометрически, используя поглощение при 260 нм. Пример 3. Условия выращиванияЗдесь используют штаммАТСС 27064. Штамм хранят на пластинах, состоящих из дрожжевого экстракта - 4 г солодового экстракта - 10 г глюкозы - 4 г агара - 20 г в одном литре дистиллированной воды рН 7,2. После 5-дневного выращивания при 30 С добавляют в чашки 2 мл стерильной воды и выращенную культуру соскабливают с поверхности агара. Полученную в результате суспензию переносят в стерильную пробирку с завинчивающейся пробкой , содержащую стеклянные шарики. После мацерации поросли культуры круговыми движениями суспензию используют для инокуляции культуры в жидкую среду. Суспензию также используют для длительного хранения культуры при -70 С после добавления глицерина до 15 конечного объема. Когда мицелий требуется для генерации протопласта для трансформации или для источника ДНК, штаммы выращивают в 1 л колбе с 200 мл УЕМЕ среды, составленной из дрожжевого экстракта - 3 г пептона - 5 г солодового экстракта - 3 г глюкозы - 10 г сахарозы - 340 г 26 Н 2 О - 1,02 г глицина - 5 г агара - 18 г в одном литре дистиллированной воды. Инкубацию осуществляют на круговой качалке при 220 об/мин при 28 С. Пример 4. Выделение геномной ДНКВегетационную поросль 48-часовой культуры, полученную так, как описано выше, собирают центрифугированием при 22100 хв течение 10 минут. Клетки снова суспендируют в 10 мл буфера ТЕ, добавляют 10 мг лизоцима, и смесь инкубируют при 30 С в течение 15 минут. Затем добавляют один мл ТЕ (рН 8), насыщенного фенолом, и 1,5 мл 5 М , и смесь осторожно инвертируют в течение 20 минут. Фазы разделяют при 12000 хв течение 10 минут, после чего водный слой удаляют и переносят в свежую пробирку. Добав 15 4382 1 ляют равный объем хлороформа, и смесь осторожно инвертируют в течение 10 минут. Фазы снова разделяют центрифугированием при 12000 хв течение 10 минут, водный слой удаляют и снова переносят в свежую пробирку. Осторожно добавляют два объема изопропанола, выпавшую ДНК извлекают и снова растворяют в минимальном объеме буфера ТЕ. Добавляют РНК( А) до конечной концентрации 20 мг/мл,и раствор инкубируют при 50 С течение одного часа. Затем добавляют протеазу К до конечной концентрации 100 мг/мл, вместе со 100 мМи 0,4, и смесь инкубируют при 37 С в течение одного часа. Раствор снова экстрагируют равным объемом ТЕ (рН 8), насыщенным фенолом, и затем еще один раз хлороформом. ДНК после конечной экстракции извлекают после добавления двух объемов изопропанола, и концентрацию определяют спектрофотометрически, используя поглощение при 260 нм. Пример 5. Создание генной библиотеки и выделение фрагмента ДНК, содержащего ген экспандазыГеномная ДНК, полученная по ранее описанной методике, переваривается с ферментами растрикциии 1. Переваренную ДНК подвергают электрофорезу на 0,8 геле агарозы, и фрагменты 1,8-2,2 элюируют и лигируют в ДНК 18, которая предварительно переварена си 1. Используют разбавление лигирующей смеси, чтобы трансформировать компетентные клетки М 09, используя электропорацию ( , -, , ). Получение компетентных клеток и условия электропорации выдерживают в соответствии с рекомендациями изготовителей. Преобразующую смесь высевают на пластины , содержащие 100 мг/мл ампициллина и 75 мл 2-. После инкубации в течение ночи при 37 С рекомбинантные колонии идентифицируют по их обесцвечиванию вследствие инактивации плазмидного вектора активности гена бета-галактозидазы. Бесцветные колонии пикируют в свежие пластины , содержащие 100 мг/мл ампициллина. После выращивания в течение ночи при 37 С колонии переносят на нитроцеллюлозу и гибридизируют с пробой, продуцированной полимеразной цепной реакцией,которая соответствует опубликованной последовательности гена экспандазыиз оснований 52-918 (а 1. (1989) . . 171 754-760 и патент США 5070020). Мечение продукта цепной реакции полимеразы выполняют в ходе реакции случайно выбранным праймером с (32 Р) СТР и, по рекомендации изготовителей (, ,). Реакцию гибридизации выполняют в присутствии 106 СРМ радиоактивно помеченной пробы, 30 формамида, 5 Х(0,15 М , 0,015 М цитрата натрия рН 7), 0,15(5 г фиколаб 5 г поливинилпирролидона и 5 на 500 мл штамма 50 Х) и 100 мг/мл ДНК тимуса теленка в течение ночи при 37 С. Некоторые трансформанты сильно гибридизуют к пробе. В одной колонии подтверждают содержание вектора, несущего ген экспандазы, путем анализа рестрикции фермента, и эта плазмида обозначается -1. Пример 6. Выделение плазмидной ДНК Культуры Е. , содержащие плазмиду, выращивают в 500 мл бульона 20 г/л основы бульона(, , Шотландия), с 15 мг/мл тетрациклина в течение 12-16 часов при 37 С на круговой качалке при 220 об/мин. Клетки осаждают центрифугированием при 4000 хв течение десяти минут при 4 С. Клеточный осадок снова суспендируют в 18 мл глюкозного буфера (50 мМ глюкозы, 25 мМ Трис рН 8,0, 10 мМ ЭДТА) и добавляют 2 мл 40 мг/мл лизоцима (, .МО) в глюкозном буфере, перемешивают и смесь инкубируют при комнатной температуре в течение 15 минут. Добавляют 40 мл свежеприготовленного раствора 0,2, 1 и смесь осторожно вращают и помещают на лед на десять минут. Затем добавляют 30 мл 5 М ацетата калия, рН 4,8, хорошо перемешивают, и образовавшуюся смесь помещают на лед еще на десять минут. Клеточные осколки осаждают центрифугированием при 4000 хв течение десяти минут при 4 С, и полученный в результате супернатант фильтруют через фильтр из марли. К осветленному супернатанту добавляют изопропанол (0,6 объемов), чтобы осадить плазмидную ДНК, и осадок формируют в процессе инкубации при комнатной температуре в течение 20 минут. Плазмидную ДНК осаждают при 4000 хв течение 20 минут при 4 С и затем промывают 70 этанолом и сушат короткое время. Осадок снова суспендируют в 9 мл буфера ТЕ, затем добавляют 10 ги 0,387 мл раствора бромэтида - 10 мг/мл. Этот раствор центрифугируют при 313100 хв течение 24 часов. Полученную в результате плазмидную полосу в хлористом цезии визуализируют ультрафиолетовым светом, выделяют, и затем удаляют бромэтид, используя для экстракции воду, насыщенную бутанолом.затем удаляют из препарата плазмиды путей диализа против ТЕ буфера, и наконец, концентрируют ДНК, используя ПЭГ ( 8000). Концентрацию ДНК определяют спектрофотометрически, используя поглощение при 260 нм. Пример 7. Построение вектора трансформацииВектор трансформацииконструируют с резистентным геном флеомицина в качестве доминантного избирательного маркера. Это осуществляют, выделяя сначала фрагмент 660 , содержащий резистентный ген флеомицина (причем флеомицин связывает ген протеина), и к тому же присоединенный к терминатору С цитохрома дрожжей, из/остаток провара плазми 16 4382 1 ды 713 (, Франция) путем электрофореза и элюирования из агарозных студней. Выделенный фрагмент лигируют в сайтвектора( ), и ориентацию гена определяют анализом фермента рестрикции. Далее, вставляют фрагмент 550 из, содержащий сайт лямбда , который дает возможность использовать вектор для образования космиды, когда включаются вставки соответствующегося размера. Затем из провара/геномного клона, содержащего ген ,выделяют фрагмент 1,5/ , содержащий участок промотора гена синтетазы (изопенициллинаметодом электрофореза и элюирования из агарозных студней. Выделенный фрагмент промоторалигируют в переваренный вектор/ . Сайтнаходится в исходном кодонегена резистантного флеомицина. Этот вектор обозначается -2. Фрагмент 1,645 , содержащий ген экспандазы, очищают от провараи- (вектор, описанный ранее) посредством электрофореза и элюирования из 0,8 геля агарозы. Выделенный фрагмент лигируют в вектор( ), также проваренный си. Этот вектор переваривается -8. Новый сайтсоздается в начальном кодоне -гена экспандазы путем сайт-направленного мутагенеза -8 при использованиимутагенезной системы,меняющей сайты ( ) ( /. Мутагенез выполняют по инструкции производителя. Строят олигонуклеотид для комплемента кодирующей последовательности участка ДНК в исходном кодонеиз опубликованной последовательности гена экспандазы (а 1. (1990),, 171, .3952-3958). Олигонуклеотид синтезируют приемами химии цианоэтилфосфорамидитирования(приборы), и олигопоследовательность выглядит следующим образом последов.8 Мутагенез подтверждается анализом фермента рестрикции. Далее, фрагмент 1,2, содержащий участок промотора гена синтетазы изопенициллина, выделяют (электрофорезом и элюированием из гелей агарозы) из проварагеномного клона, содержащего ген . Участок промоторалигируют в вектор -8 в новый сайт, созданный мутагенезом в начальном кодоне-гена экспандазы. Ориентацию промотора относительно гена экспандазы устанавливают анализом фермента рестрикции. Это сочетание- промоторген экспандазы - затем перемещают в виде фрагмента Ва /в разрезанный Ва /вектор трансформации -2 , описанный выше. Конечная конструкция обозначается . Пример 8. Клонирование промотора -тубулина . Ген -тубулинаклонируют из геномной библиотеки , используя ген -тубулинав качестве пробы гибридизации. Последовательность этого клона и сравнение с известной аминокислотной последовательностью гена -тубулина изидентифицирует участок с 91 гомологии, начиная с начального кодона . Последовательности, содержащие функциональный промотор, выделяют между начальным кодоном и сайтомна 1,4 . Построение вектора трансформации, несущего промотор -тубулинаФрагмент 2,0/ , содержащий промотор -тубулина , лигируют в вектор( ), также переваренный с / . Новый сайтсоздают в начальном кодонесайт-направленным мутагенезом, используямутагенезную систему, меняющую сайты( ). Мутагенез выполняют по инструкции изготовителя. Конструируют олигонуклеотид,комплементарно к сайтовому участку исходного , но который содержит некоторые изменения для создания сайта, и используют для мутагенеза. Синтезируют олигонуклеотид приемами химии цианоэтилфосфорамидитирования (аппаратура), и олигопоследовательность имеет следующий вид посл.9 Мутагенез подтверждается анализом фермента рестрикций. Далее фрагмент 1,4/ , содержащий промотор -тубулина , лигируют в выстроенный сайтвгена экспандазы в Ва /- переваренного вектора -8 (вектор описан ранее в примере 7). Этот вектор обозначают-8. Фрагмент 1,4 Ва / , содержащий промотор -тубулина, также лигируют в Ва /переваренного вектора -2 (вектор описан ранее в примере 7). Такое лигирование располагает промотор-тубулина прямо перед резистентным геном флеомицина. Этот вектор обозначают рС-6. Далее, фрагмент 2,4 к Ва /из вектора -8, который содержит кассету -тубулинового промотора гена экспандазы, лигируют в/переваренного вектора рС-6, чтобы получить конечный вектор трансформации , в котором ген экспандазыи резистантного маркера флеоммицина экспрессируют из промотора -тубулина. Этот вектор обозначают -2. 4382 1 Пример 9. Клонирование промотораГен глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназыклонируют из лямбда-геномной библиотеки, используя генизв качестве пробы гибридизации. Четыре потенциальных позитива исследуют далее спродуктом, генерированным из праймеров для участка 5 гена(, Н.,а 1., (1991), . .., 71, 145-150). Олигонуклеотиды для праймеров, цепной реакции полимеразысинтезируют приемами химии цианоэтилфосфорамидитирования (приборы) и олигопоследовательности являются следующими послед.10 послед.11 Один из четырех предполагаемых позитивов кросс-гибридизирует в продукт . Фрагмент 4 из этого геномного клона лигируют врасщепленного вектора( ) для секвенирования. Этот вектор обозначают -0. Секвенирование этого фрагмента идентифицирует кодон инициаторапутем сравнения с известной последовательностью генацефалоспорина. Построение вектора трансформации, несущего промоторДля построения промоторас геном экспандазысоздают новый сайтвгенапутем сайт-направленного мутагенеза, используя вектор -0. Мутагенез осуществляют по инструкции изготовителя. Конструируют олигонуклеотид, который комплементарен кодирующей последовательности участка ДНК в начальном кодонегена , но сочетая с изменением оснований, чтобы создать сайт. Олигонуклеотид синтезируют приемами химии цианоэтилфосфорамидитирования (оборудование) и олигопоследовательность имеет следующий вид послед.12 Мутагенез подтверждается анализом фермента рестрикции. Далее, фрагмент 1,9 к /из-0, который содержит промотор , лигируют в /переваренного вектора -8 (вектор описан ранее в примере 7) для позиционирования промоторас геном экспандазы . Этот вектор обозначают -0-1. Далее, фрагмент 3,0/из вектора -0-, который содержит кассету (промотор ) (экспандаза), лигируют в/переваренного вектора рС-6 (вектор описан ранее в примере 8), и получают конечный вектор трансформации-1, в котором ген экспандазыэкспрессирован из промотора . Пример 10. ТрансформацияПротопласты из описанного выше штаммагенерируют путем инокуляции 50 мл бульон СМ 1 Х 107 спорами в течение 67 часов при 25 С на круговой качалке при 220 об/мин. Мицелий собирают фильтрацией на марлевых фильтрах, переносят в 500 мл колбы и снова суспендируют в 25 мл КМР(0,7 М КС 1, 0,8 М маннита, 0,02 М КН 24, рН 6,3, содержащей 100 мг новоцима 234 ( , , Дания) и ставят для инкубации при 30 С и 100 об/мин. Сферопласты отделяют фильтрацией через марлевые фильтры и фильтры из стекловолокна и осаждают центрифугированием при 350 хв течение 10 минут. Сферопласты затем промывают три раза 10 мл буфера КМР, и затем снова суспендируют в КМРС/КМР с 50 мл 2 (до концентрации 5107 клеток/мл и оставляют при комнатной температуре на 20 минут. Для трансформации 200 мл суспензии сферопласта добавляют к ДНК (5 мг вектор ДНК в 6,2 мл КМРС с 5 мг/мл гепарина) вместе с 50 мл РРС (40 ПЭГ, 3500, 20 мМ КН 2 О 4, рН 6,3, 52 добавляют непосредственно перед применением) и трансформационную смесь инкубируют на льду в течение 30 минут. Добавляют 1 мл свежеприготовленного РРС, и смесь переносят в 50 мл расплавленного(50 С) регенерационного агара (СМ плюс 1,3 М маннита и 3 агара). Трансформационную смесь затем распределяют в две чашки Петри. После регенерации в течение 24 часов при 25 С пластины накрывают(1 пептона в 1 агаре), содержащим 100 мг флюомицина на 50 мл . Количество покрывающего материала равно количеству регенерационного агара. Пластины инкубируют при 25 С в течение 7-14 дней и наблюдают генерацию колоний трансформанта. Пример 11. ВЭЖХ-анализ продуктов ферментации адипоил-6-АРА и адипоил-7-АСА Используют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), чтобы проконтролировать образование адипоил-6-АРА в нетрансформированном штамме . , который используют, и образование адипоил-7-АСА в штамме трансформированного Р. , который используют. Анализ проводят на системес 625 системой подачи растворителя, детектор 490 Е с переменной длиной волны, установленный на 220 нм и 254 нм, с системой данных 825 , и колонкой -18 в качестве неподвижной фазы. Подвижная фаза (при скорости потока 1 мл/мин) состоит из 2 метанола и 980,010 М 18 4382 1 КН 2 РО 4, изократно рН 7,0 - 5 минут, и метанола в 0,010 М КН 2 РО 4 с линейным градиентом 2-40- 15 минут. Количество адипоил-6-АРА определяют, используя стандартную кривую поглощения стандарта пенициллинапри 220 нм, и количество адипоил-7-АСА определяют, используя стандартную кривую стандарта дезацетоксицефалоспорина С при 254 нм. Анализ чувствительности адипоил-6-АРА и адипоил-7-АСА к обработке пенициллиназой осуществляют, добавляя к фильтратам 1 единицу пенициллиназыили пенициллиназына мл и инкубируя при комнатной температуре в течение 10-30 минут. Эти образцы пропускают при идентичных условиях ВЭЖХ, описанных выше. Анализ Уф-спектров продуктов адипоил и адипоил-7-АСА осуществляют, используя системус системой 510 подачи растворителя, фотодиодным детектором, с системой данных 990 и колонкой-18 в качестве неподвижной фазы. Используют подвижную фазу, идентичную описанной выше. Выделение большого количества продукта адипоил-7-АСА из цельного ферментационного бульона делают, используя системус 510 системой подачи растворителя, фотодиодным детектором 990, системой данных 990 и препаративной колонкойС 18 в качестве неподвижной фазы. Подвижная фаза(при скорости потока 5 мл/мин) изократная - 0,010 М КН 2 РО 4, рН 7,0, в течение 35 минут. Пик поглощения,соответствующий времени удержания адипоил -7-АСА-продукта, собирают, используя коллектор фракций. Пример 12. Проверка биоактивности Антибиотическую активность продуктов ферментации адипоил-6-АРА и адипоил-7-АСА, выделенных ВЭЖХ, определяют, используя диффузионную биопробу на агаре . Двадцать мл выделенного продукта наносят на 5 мм диски на пластинах агара /20 г на л основного бульонас 3 агара (, , Шотландия)/, засеянныеАТСС 33677, или суперчувствительным штаммом Е.(поставляемого проф.. , ).используют в качестве индикаторного штамма для проверки продукта адипоил-6-АРА, и суперчувствительный штамм Е.используют в качестве индикаторного штамма для проверка адипоил-7-АСА. После 15-часового инкубирования при 37 С гало подавленной поросли индикаторной бактерии вокруг диска указывает, что продукты, проявляют биоактивность. Контрольные образцы в этом эксперименте включают дезацетоксицефалоспорин С, цефалоспорин С,пенициллини в качестве контрольного образца для подтверждения -лактамных структур - агар, содержащий пенициллиназу или не содержащий пенициллиназу. Пример 13. Проверка ферментаОчищенный продукт адипоил-7-АСА из цельного ферментационного бульона используют в качестве субстрата для определения специфической активности фермента(доступен коммерчески от.). Реакционную смесь, содержащую 10 мМ субстрата, 1 мг фермента , 5 глицерина в 0,16 М КН 24 в общем объеме 50 мл, инкубируют при 37 С. Отбирают 5 мл аликвоты во временных точках 0, 1, 3,5, 10, 20 и 30 минут, разбавляют 33 мл 0,010 М К 2 РО 4, рН 3,5, и замораживают при -70 С, перед анализом методом ВЭЖХ при условиях, описанных ранее. Активность ферментапо отношению к колориметрированному субстрату адипоил-аминобензойной кислоты проверяют, используя 5 мМ субстрата, 8,25 мг фермента , 10 глицерина в 0,065 М КН 2 РО 4, рН 7,0, в общем объеме 50 мл в течение 30 минут при 37 С. Реакцию выполняют в 96 ячеичной чашке микротитратора. Пятьдесят млМ 2 разбавленного 0,25 М уксусной кислотой в соотношении 1100, добавляют, чтобы закончить реакцию, и реакционную смесь оставляют при комнатной температуре на 3 минуты. Добавляют 100 мл раствора в воде гидрата мононатриевой соли 4-амино-5-гидрокси 2,7-нафталиндисульфоновой кислоты (10-мг/мл), разбавленного 0,5 М аНСО 3 в соотношении 1100, и немедленно определяют окраску при 515 нм, используя 312 -(приборы ). Пример 14. ВЭЖХ-анализ продукта реакции ферментаВсе проверки фермента(коммерчески доступного от.), в которых используют субстрат адипоил-7-АСА, при контроле методом ВЭЖХ работают с системойс системой подачи растворителя 625, детектором 490 Е с переменной длиной волны на 203 нм, и 254 нм, системой данных 825 - и колонкой -18 в качестве неподвижной фазы. Подвижная фаза (при скорости потока 1 мл/мин) состоит из 2 метанола и 980,010 М 2 РО 4, рН 3,5 - 5 минут изократно, и метанола, в 0,010 М К 2 РО 4 рН 3,5, с линейным градиентом 2-40- 15 минут. Используют стандарт 7-, чтобы контролировать время удержания продукта реакции. Количество продукта реакции вычисляют, используя стандартную кривую стандарта 7- при 254 нм. Пример 15. 13 С-ЯМР-анализ продукта ферментации адипоил-7-АСА Спектры 13 С-ЯМР (широкополосный протонный сдвиг) получают при 75,4 Мгц (7,1 Т) на спектрометре 350 (в). Образцы состоят из 50 мг продукта адипоил-7-АСА из фермента 19 4382 1 ционного бульона в 0,5 мл 20 (99,8, ) или в 0,5 мл -6 (99,0, ), трубки 5 мм,350 К. Данные ЯМР подтверждают определение продукта как адипоил-7-АСА. Пример 16. Оценка альтернативных ферментов адипоилацилазы В дополнение к исследованиям, использующим фермент , демонстрируется удаление боковой адипоильной цепи из адипоил-7-АСА (и других соединений с адипоилом) с помощью ферментов, полученных из ряда микробных источников. На начальной стадии штаммы-83 и -495 (депонированные впод регистрационными номерамиВР-817 иВР-818 соответственно) и штамм-77-1 (депонированныйпод регистрационным номеромВ-8070) выращивают в течение 72 часов в среде, содержащей -2,0(вес/объем) мононатрийглутамат - 0,5(вес/объем) дрожжевой экстракт - 0,5(вес/объем) порошок вымоченной кукурузы - 0,2(вес/объем) хлопковое масло - 0,5(вес/объем) и глутаровую кислоту 0,1(вес/объем). Клетки собирают центрифугированием и промывают 50 мМ фосфатным буфером, рН 8,0 затем их снова суспендируют в буфере и делают проницаемыми внешние мембраны путем добавления небольшого объема хлороформа. Аликвоты суспензии клеток затем смешивают с адипоилнитроанилином(-) и инкубируют при 30 С в течение 2-18 часов. После инкубации смеси подкисляют путем добавления 10(объемн.) уксусной кислоты. Затем колориметрическим способом определяют освободившийся нитроанилин после его конверсии в диазосоединение, используя реагенты, предложенные в форме комплектадля испытаний гамма-глутамилтрансферазы (545-А). Относительные активности трех штаммов составляют 100 , 85,5 и 48 для -495, -83 и -77-1 соответственно. Используя способы, подобные описанным выше для фермента , демонстрирует также активность -83 и -495 на адидоал-7-АСА. Продуцирование -лактамазы -77-1 предотвращает проявление дезацилирующей активности этого штамма относительно адипоил-7-АСА. Подобным способом также демонстрируют продуцирование адипоилацилазы для двухгрибных штаммов( . МА-133, АТСС 20492 и. МА-13, АТСС 20491, ссылка - патент США 4141790.) и штаммов трехбактериальных (, АТСС 14649 АТСС 14648 и , АТСС 14650), которые описаны как продуценты ацилазы цефалоспорина С в патенте США 3239394, ., . Список последовательностей Тип молекулы ДНК (геномная) Тип молекулы ДНК (геномная) Тип молекулы ДНК (геномная) Тип молекулы ДНК (геномная) Тип молекулы ДНК (геномная) Тип молекулы ДНК (геномная) Тип молекулы ДНК (геномная) Тип молекулы ДНК (геномная) Тип молекулы ДНК (геномная) Национальный центр интеллектуальной собственности. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 22