Способ приготовления гистохимических препаратов для исследования активности моноаминооксидазы А и В мозга

ГОУДАРСТВЕЙНОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВО РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ(54) СПОСОБ ПРИГОТОВЛЕНИЯ гИСтОхИмИчЕСш/хх ПРЕПАРАТОВ для. ИССЛЕДОВАНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНООКСИДАЗЫ А И В мОзгАСпособ приготовления гистохимических препаратов для исследования активности моноаминооксидазы А и В мозгалзключающшй замораживание нефиксированных образцов мозга, получение криостатных срезов, предварительную обработку их в растворах специфических ингибиторов А и В и последующую обработку в инкубационном растворе, содержащем пероксидазу хрена, тирамищбуферный раствор и заключение срезов,отличающийся тем, что инкубационный раствор дополнительно содержит Зд-диаминобензидин, никель-аммоний сульфат, азид натрия, в качестве буферного раствораТРИС-соляный буфер при следующем содер Изобретение относится к области биохимии,а именно к гистохимии и может использоваться для исследования моноаминооксидазы А и Б в структурах мозга. Наиболее близким к заявляемому является гистохимический способ исследования МАО,включающий замораживание свежих образцовмозга, получение криостатных срезов, прени кубацию их с раствором 10 М депрешалщили 10 М хлоргилина, или в смеси обоих ингибиторов в той же концентрации, и последующую инкубацию в растворе, содержащем З-амино 9-этилкарбазол 0,2 мл, диметилформамдид (для(73) Патентообладатель Гродненский государственный медицинский институт (В)Зд-диаминобевзидин 0,08 мг никель-аммоний сульфат 6,0 мг пероксидаза хрена 1,0 мг тирании 1,0 мг азидиатрия 0,65 мг1.111 оц 5111 эу 1., 61 оуег Ж, 5 апб 1 ег М.,Нйзтосьешйс 1 оса 112 ат 1 оп от шопоапппо охйдаве А апс 1 В гат Ьгайп, Т Мента Тгапвш, 1988,у. 74, р 29.растворения хромогена) 0,05 мл, пероксидазу хрена 0,25 мг, тирамин или бензиламин по 1,2 мг, растворенные в 0,05 М фосфатном буфере рН 7,6 (дозировка в. перерасчете на 1 млА раствора). После инкубации препараты про мывались в 0,9 растворе хлористого натрия и постфнксировались 2 часа в 10 формалине, после чего заключались в глицериновый гель 1.препараты с нечеткой окраской, выраженным фоном, затрудняющим локшщзапию окрасившихся структур и их дифференцировку- препараты длительно не сохраняются, т.к. хромоген разлагается под действием света- недостаточно высокое качество препаратов,выраженное в нечеткой окраске.Задача изобретения - улучшение качества препаратов, обеспечение возможности их длительного хранения без изменения окраски.Поставленная задача достигается тем, что в способе приготовления гистохимических препаратов для исследования активности моноаминооксидазы А и В мозга, включающим замораживание нефиксированиых образцов мозга, получение криостатных срезов, предварительную обработку их в растворах специфических ингибиторов А и В и последующую обработку в инкубационном растворе, содержащем пероксидазу хрена, тирамищбуферный раствор и заключение срезов, инкубационный раствор дополнительно содержит 3,3-диаминобензндин, никель-аммоний сульфат,азид натрия, в качестве буферного раствора ТРИС-соляньш буфер при следующем содержании компонентовЗд-диаминобензидин 0,08 мг никель-аммоний сульфат 6,0 мг пероксидаза хрена 1,0 мг тирамин 1,0 мг азид натрия 0,65 мгсрезы обезвоживают в спиртах, проснетляют в кснлоле и заключают в полистирол. Способ осуществляют следующим образом. После декапитации животных нефиксированные кусочки мозга помещают на полоскифильтровальной бумаги, что позволяет четко их маркировать, замораживают в жидком азоте, готовят из них серийные криостатные срезы толщиной 20 - 25 мкм, которые монтируют на предметные стекла (по 4 стекла с каждоюскими ингибиторами А и Б или их смесью, в срезах оставшеюся стекла в последующем выявляется полная активность МАО. После чего все 4 стекла инкубируют 2 - 5 часов во влажной камере в инкубационном растворе, состоящем из 0,08 мг диаминобензидина, 1 мг пероксидазы хрена, 6 мг никель-аммоний сульфата, 0,65 мг азида натрия, 1 мг тирамина гидрохлорида, растворенных в 1 мл 0,05 М трис-НС 1 буфера рН 7,6. Затем срезы ополаскивают в физиологическом растворе, обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации,просветляют в ксилоле и заключают в полистирол. В результате использования предлагаемого способа приготовления гистохимических препаратов для исследования МАО А и Б в мозге выявлены его следующие преимущества по сравнению с прототипом- улучшается качество препаратов за счет получения более интенсивной и четкой окраски структур мозга- обеспечивается возможность длительного хранения препаратов без изменения окраски за счет использования стойкого к органическим растворителям и свету хромогена.Способ прост в осуществлении, достаточно надежен и хорошо воспроизводим и может быть использован в любой гистохимическойГосударственное патентное ведомство Республики Беларусь.