Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид К2Р со свойствами активатора плазминогена, полипептид К2Р со свойствами активатора плазминогена, рекомбинантная плазмидная ДНК рА27.3, кодирующая полипептид К2Р со свойствами активатора плазменогена и фармацевтическая

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ ФРАГМЕНТ ДНК, КОДИРУЮЩИЙ ПОЛИПЕПТИД К 2 Р СО СВОЙСТВАМИ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА, ПОЛИПЕПТИД К 2 Р СО СВОЙСТВАМИ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА,РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК рА 27.3, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД К 2 Р СО СВОЙСТВАМИ АКТИВАТОРА ПЛАЗМИНОГЕНА И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ(71) Заявитель БЕРИНГЕР МАННХАЙМ ГМБХ(73) Патентообладатель БЕРИНГЕР МАННХАЙМ ГМБХ 2120 1 1. Фрагмент ДНК, кодирующий полипептид К 2 Р со свойствами активатора плазминогена, имеющии нуклеотидную последовательность 1 61 121 181 241 301 361 421 481 541 601 661 721 781 841 901 961 1021 содержащий АТС стартовый кодон. 2. Полипептид К 2 Р со свойствами активатора плазминогена, полученный путем трансформации бактериального штамма рекомбинантным вектором, включающим фрагмент ДНК с последовательностью, приведенной в п. 1 или аналогичной последовательностью, определяемой вырожденностью кода со следующими свойствами- увеличенный период полураспада по сравнению с природным аналогом- растворимость в растворе аргинина в концентрации 10-1000 ммоль/л при чистоте продукта 95. 3. Рекомбинантная плазмидная ДНК рА 27.3, кодирующая полипептид К 2 Р со свойствами активатора плазминогена, содержащая - фрагмент ДНК плазмиды 7685- 5 Т ТСТТАС СААААС 3 - синтетический фрагмент ДНК,- фрагмент ДНК плазмиды 7685, три участка расщепления рестриктазы , один участок расщепления рестриктазы , - промотор, генетические маркеры- ген устойчивости к ампицилину, - ген устойчивости к канамицину. 4. Фармацевтическая композиция, обладающая фибринолитической активностью, содержащая активатор плазминогена и фармакологически приемлемый носитель, отличающаяся тем, что в качестве активатора плазминогена она содержит полипептид К 2 Р по п. 2 в эффективном количестве. Изобретение относится к новому производному, ДНК-последовательности, которая кодирует новое -РА-производное, плазмидам экспрессии, которые обладают кодирующей -РА-производное ДНКпоследовательностью, а также к средству растворения сгустков, содержащему -РА-производное. Свернувшаяся кровь содержит в качестве основной компоненты протеиновой матрицы полимерный фибрин. Фибрин растворяется благодаря фибринолитической системе при физиологических условиях в последовательности реакций, которая подобна последовательности свертывания крови. Центральной реакцией при этом является активирование плазминогена в плазмин, которое вызывается, например, активатором плазминогена ткани - (ткань типа активатора плазминогена). Плазмин снова растворяет фибрин, который представляет собой основную компоненту протеиновой матрицы свернутой крови. Ферментативная активность природного или полученного гентехнологически из эукарионтов -, а именно каталитическое активирование плазминогена в плазмин, в отсутствие фибрина или продуктов расщепления фибриногена очень незначи 2 2120 1 тельна, однако, в присутствии этих протеинов может отчетливо повышаться, а именно более, чем на фактор 10 (патент ЕПВ 0302456).- расщепляется в крови благодаря имеющимся протеазам на А- и В-цепь. Обе образовавшиеся цепи остаются связанными через цистеиновый мостик. Стимулируемость активности - представляет собой решающее преимущество по сравнению с другими известными активаторами плазминогенов, как, например,урокиназа или стрептокиназа (см., например, .и др., . . ., 257 (1982), 2912-2919 и др. .755, (1983/531-533). Механизм действия - ин виво описан, например,и , . , 46,(1981), 561-565. Сфокусированная на поверхности фибрина активность фермента позволяет ему вести себя как пригодное средство для борьбы с патологическими закупорками вен (например, при инфаркте сердца), что большей частью может быть подтверждено клиническими испытаниями ( и др., , 70 (1984), 1012 , 73 (1986/511). В качестве надостатка -РА, однако, нужно рассматривать его быстрое уменьшение концентрации в плазме(клиренс). Следствием этого является то, что необходимо относительно большое количество -РА, чтобы достичь ин виво эффективного лизирования тромбов. Высокие лечебные дозы опять же имеют следствием побочные действия, как, например, кровотечения. В европейском патенте 0196920 описан природный продукт разрушения -РА, который содержит только еще домены протеазы и крингель-П и -конец которого начинается с аланина 160 (в расчете на указаннуюи др. в 301 (1983) 214-221 последовательность аминокислот). Скорость клиренса этого продукта разрушения -РА, однако, несущественно отличается от таковой природного -РА. Лишь благодаря химической модификации каталитической области за счет введения блокирующей группы можно здесь достичь улучшения. Поэтому задачей изобретения является изменение -РА таким образом, чтобы образовавшееся производное обладало сильно сниженной скоростью клиренса и таким образом более длительным временем полураспада в плазме крови. При этом должны сохраняться лизирующее тромбы действие, а также стимулируемость фибрином. Активатор плазминогена ткани (-РА-производное), который отличается тем, что он не гликозилирован,состоит из следующей последовательности аминокислот 1 которая на амино-конце, т.е. на аминокислотеможет быть еще продлена за счет М. Неожиданно установлено, что делеция остальных, имеющихся в нативном -РА областей не оказывает никакого влияния на тромболитическую эффективность протеина и зависящая от бирина стимулируемость мутеина сравнима с таковой нативного -РА. Правда, установлено, что в предлагаемом согласно изобретению -РАпроизводном отсутствует свойство связывания фибрина, однако, несмотря на это, неожиданно обнаружена ин виво эффективность тромболиза, которая даже существенно улучшена по сравнению с таковой нативного -. Также неожиданным является тот факт, что при введении тромболитически достаточной эффективной дозы производного почти не оказывается влияния на системный фибринолиз. Следовательно, оказалось, что предлагаемое согласно изобретению -РА-производное обладает типичным для нативного -РА свойством специфичности к фибрину при физиологических условиях. Эти результаты получены из фармакологических исследований предлагаемого согласно изобретению производного (см. примеры 6 и 7). Кроме того, предлагаемый в изобретении протеин обладает очень высокой удельной (специфической) активностью. При применении описанного ренатурирования уже определены активности 500-800 /мг. Предметом изобретения является ДНК-последовательность, которая кодирует полипептид К 2 Р со свойствами активатора плазминогена и содержит следующую нуклеотидную последовательность 1 61 121 181 241 Выбор плазмиды, в которую внедряется кодирующая предлагаемое в изобретении -РА-производное ДНКпоследовательность, зависит от используемых позднее для экспрессии производного клеток-хозяев. Пригодные плазмиды, а также минимальные требования, которые предъявляются к такого рода плазмиде (например, источник репликации, место рестрикционного разреза) известны специалисту. В рамках изобретения, однако, вместо плазмиды также можно применять космиду, репликативные, двунитевой формы фаги (, 13) и другие, известные специалисту векторы. Методы направленного мутагенеза (определяемый сайтом мутагенез) описаныи др., , 21 (1984), 634, и осуществляется по существу как там описано. Далее, следующим предметом изобретения является способ получения предлагаемого в изобретении -производного, отличающийся тем, что одна из предлагаемых в изобретении плазмид экспримируется в пригодные клетки-хозяева и продукт получается из питательной среды, в случае необходимости после разрушения клеток-хозяев. Предпочтительно для получения предлагаемого в изобретении -РА-производного в качестве клеток-хозяев применяют прокарионтные клетки. При этом опять же особенно предпочтительно, чтобы образующиеся при этом так называемые внутриклеточные тельца (нерастворимые протеиновые агрегаты) сначала отделялись от растворимых частиц клеток, содержащие -РА внутриклеточные тельца солюбилизировались(растворялись) при восстанавливающих условиях путем обработки гуанидин-гидрохлоридом, затем их нужно дериватизировать с помощьюи, наконец, ренатурировать -РА-производное путем добавки -аргинина и. Точные методики активирования -РА из внутриклеточных телец описаны, например, в европейских патентах А-0 219 874 и А-0 241 022. Однако согласно изобретению, также можно использовать любые другие способы получения активного протеина из внутриклеточных телец. В случае предлагаемого в изобретении способа для очистки К 2 Р предпочтительно работают в присутствии -аргинина, в особенности при концентрации 10-1000 ммоль/л. Предлагаемое в изобретении отделение от чужеродного протеина путем аффинной хроматографии осуществляется в предпочтительном варианте осуществления изобретения через -адсорбирующую колонну(ЕТэритрина-трипсин-ингибитор). При этом ЕТ фиксируется на материале носителя (абсорбер), как, например, сефароза. Очистка через ЕТ-адсорбирующую колонну имеет то преимущество, что материал ЕТадсорбирующей колонны может загружаться непосредственно из концентрированной смеси ренатурирования даже в присутствии таких высоких концентраций аргинина, как 0,8 моль/л аргинина. Агрегации К 2 Р, которая имеет место при низких концентрациях аргинина ниже 10 ммоль/л, благодаря этому избегают. Особенно предпочтительно поэтому осуществлять очистку К 2 Р через ЕТ адсорбирующую колонну в присутствии 0,6-0,8 моль/л аргинина. Содержащий К 2 Р раствор при этом предпочтительно имеет рН выше 7,особенно предпочтительно 7,5-8,6. Элюирование из ЕТ-колонны осуществляется путем снижения рН как в присутствии, так и также в отсутствие аргинина, при условиях, которые обеспечивают хорошую растворимость К 2 Р. Предпочтительно рН-значение при элюировании лежит в кислой области, особенно предпочтительно в области 3-5,5. Полученный согласно изобретению К 2 Р обладает удельной -РА-активностью 550.000200.000/мг при чистоте свыше 95, предпочтительно выше 99. Согласно изобретению, следовательно, получается -РА-производное, которое обладает отчетливо более продолжительным временем полураспада плазмы на основании пониженной скорости клиренса. Предлагаемое согласно изобретению производное, однако, благодаря этому не теряет никаких своих свойств, делающих его пригодным в качестве лекарственного средства для тромболиза артериальных и венозных сгустков. Напротив, необходимые для тромболитической терапии с помощью К 2 Р дозы снижается по крайней мере на четверть обычной в случае нативного -РА дозы. В случае одинаковых доз К 2 Р и нативного -РА система свертывания за счет К 2 Р затрагивается менее, чем благодаря нативному -РА, и время кровотечения удлиняется незначительно в отличие от нативного -РА, так что осложнения за счет кровотечения при терапии с помощью К 2 Р могут по возможности уменьшаться. 2120 1 Предлагаемое согласно изобретению -РА-производное поэтому особенно пригодно для использования в лекарственном средстве, что опять же составляет следующий предмет изобретения. При применении предлагаемого в изобретении -РА-производного в лекарственных средствах для достижения одинаковой эффективности требуется только еще отчетливо сниженная доза введения, чем это имеет место в случае применения нативного,продуцированного в СНО -РА. Следующие примеры далее поясняют изобретение в сочетании с рисунками. Фиг. 1 показывает схематически получение плазмиды рА 27.3 Фиг. 2 показывает сравнение связи фибрина предлагаемого в изобретении -РА-производного (кривая ) с экспримированным в СНО-клетках нативным -РА (двунитевой -РА из СНО-клеток, расщепленных на физиологическом месте расщепления 275- 276 (кривая 2) и однонитевой -РА из СНО-клеток (кривая 3). Фиг. 3 и фиг. 4 показывает диаграммы фармакокинетики -РА-активности предлагаемого согласно изобретению -РА-производного, по сравнению с выпускаемым в продажу -РА-препаратом А) (кривая 1 К 2 Р, доза 200 000 ед./кг 0,25 мг/кг внутривенное вливание через 30 минут число исследованных животных (кролики)4. Кривая 2 доза 200 000 ед/кг внутривенное вливание, через 30 минут, число исследованных животных (кролики)6). Фиг. 5 показывает кривые действия доз (для кроликов) на тромболиз предлагаемого согласно изобретению РА-производного, по сравнению с . (показано среднее значение, 1000 кривая 1 К 2 Р кривая 2 ). Фиг. 6 показывает ход во временивремени кровотечения (ВТ) до и после внутривенной инъекции пилюлиплацебо или повышающихся доз находящийся под наркозом собакам. Фиг. 7 показывает ход во временивремени кровотечения (ВТ) до и после внутривенной инъекции пилюли плацебо или повышающихся доз К 2 Р находящимся под наркозом собакам. Пример 1. Конструкция плазмиды рА 27.3. Исходная плазмида р 7685, описанная в европейском патенте А-0 242 836, содержит следующие компоненты -промотор, регион ас-оператора с АТС-стартовым кодоном, кодирующий регион для -РАпроизводного К 2 Р, терминатор транскрипции из рКК 223-3, ген -лактамазы, ген резистентности к канамицину и область начала плазмиды рАСУС 177, плазмиды, которая находится в клетке в низком числе копий. Последовательность -РА-производного К 2 Р складывается вместе из нуклеотидов 180-336 (-домены), 7151809 (К 2-домены, протеазы, меньшая доля 3-Т) и АТ-стартового кодона. Положения нуклеотидов даны согласно последовательности, описаннойи др., 301 (1983) 214-221. Для делеции -доменов из К 2 Р-конструкции в плазмид р 7685 по существу используют методи сотр.21(1984) 634. Для образования гетеро-дуплекса из р 7685 изолируют два фрагмента. Фрагмент А р 7685 расщепляют с помощью рестрикционного фермента Есо. Продукты расщепления разделяют с помощью гель-электрофореза и больший фрагмент Есо элюируют из геля. Фрагмент В плазмиду р 7685 линеаризируют с помощью рестрикционного фермента Х. Линеаризированную плазмиду также получают препаративно гель-электрофорезом. Для мутагенеза готовят синтетически следующий олигонуклеотид 5 Т ТСТ ТАС СААААС АТ 3 Для образования гетеродуплекса фрагмент А, фрагмент В (по 450 моль) и олигонуклеотид (75 моль) смешивают и в присутствии 50 ммоль/л , 10 ммоль/л Трис/, рН 7,5 и 10 ммоль/л О 4 инкубируют сначала три минуты при 100 и тотчас переносят на лед. Ренатурация ДНК происходит за 30 минут при 60 С. Для репаратурного синтеза к гетеродуплексу добавляют следующее дезоксинуклеотидтрифосфаты (0,2 ммоль/л, АТР(1 ммоль/л,(100 ммоль/л), рис-,7,5 (6,5 ммоль/л), 2 (8 ммоль/л), в-меркаптоэтанол (1 ммоль/л), фрагмент Кленова ДНК-полимеразы из . (0,125 ед/мкл смеси) и Т 4-лигазу (0,1 ед/мкл смеси). Репаратурный синтез осуществляют в течение 4-х часов при 16 С. Затем эту смесь трансформируют в клетки Е.со (М 82, М 3689) с помощью ас -плазмиды и трансформанты селекционируют путем добавки 25 мкг/мл канамицина к питательной среде. С помощью способа гибридизации колоний при применении вышеописанного олигонуклеотида мутагенеза в качестве зонда можно выбирать те клоны, которые несут плазмиду рА 27.3, которая кодирует предлагаемое в изобретении -РА-производное К 2 Р. Эта плазмида отличается от исходной плазмиды р 7685,между прочим, отсутствием мест разреза Р , соответственно. Эти оба места разреза содержатся в любой области исходного плазмида, которая кодирует -домены. Конструкция плазмиды рА 27.3 схематически представлена на рис.1. Пример 2. Получение активного -РА-производного К 2 Р из Е.сои получение внутриклеточных телец (В). 1,6 кг влажной клеточной массы Е.Со М 3689, трансформирована с помощью плазмида рА 27.3 (суспендируют в 10 л 0,1 моль/л Трис-НС 1, 20 ммоль/л ЭДТК, рН-6,5, при 4 С). К этой смеси добавляют 2,5 г лизоцима и инкубируют 30 минут при 4 С затем полное переведение клеток в удобную для переработки форму осуществляют путем диспергирования при высоком давлении. К полученному раствору примешивают 5 л 0,1 ммоль/л Трис-НС 1, 20 ммоль/л 5 2120 1 ЭДТК, 6 Тритона Х 100 и 1,5 ммоль/л С 1, рН 6,5, и инкубируют следующие 30 минут при 4 С. Затем осуществляют отделение нерастворимых составных частейпутем центрифугирования с помощью центрифуги Р. Осадок после центрифугирования суспендируют в 10 л 0,1 ммоль/л Трис-НС 1, 20 ммоль/л ЭДТК, рН 6,5, инкубируют 30 минут при 4 С и В -препарат выделяют путем последующего центрифугирования. Солюбилизация В. 100 г В (мокрый вес) суспендируют в 450 мл 0,1 ммоль/л Трис-НС 1, 6 ммоль/л гуанидин-гидрохлорида,0,2 ммоль/л ДТЕ (1,4-дитиоэритрит 1 ммоль/л ЭДТК, рН 8,6, и перемешивают при 25 С 2,5 часа). После установления рН-значения 3 с помощью НС 1 (25) осуществляют диализ против 10 ммоль/л НС 1 (Х х 50 л, 24 часа, 4). Дериватизация. Вводят гуанидин-гидрохлорид (твердый) так, чтобы после конечного разбавления вышеуказанного диализата с помощью 10 ммоль/л 1 концентрация гуанидин-гидрохлорида составляла 6 ммоль/л. Реакционную смесь предварительно инкубируют при 25 С в течение 1,5 часов, затем вводят окисленный глютатиондо 0,1 ммоль/л и Трис-1 до 0,05 ммоль/л и рН-значение доводят по титру до 9,3 с помощью 5 ммоль/л . Смесь перемешивают в течение 3,5 часов при 25 С. После установления рН-значения 3 с помощью 1 (25) осуществляют диализ против 10 ммоль/л 1 (3 х 100 л 48 часов, 4 С). После диализа центрифугируют и прозрачную надосадочную жидкость обрабатывают далее. Натурирование. Реакционный сосуд емкостью 10 л заполняют 0,1 ммоль/л Трис-1, 0,8 ммоль/л -аргинина, 2 ммоль/л(гентатион, восстановленная форма), 1 ммоль/л ЭДТК, 8,5. Ренатурирование проводят при 20 С путем трехкратной добавки, смотря по обстоятельствам, 100 мл производного (смешанный дисульфид, см. выше) в отрезок времени 24 часа. После ренатурирования получают материал с удельной активностью 1500-10.000(мг) определение см. пример 4 б). Единицаединица активности по определению , Национального Института по биологическим стандартам и контролю. Концентрирование ренатурированной реакционной смеси. Ренатурированную смесь при необходимости можно концентрировать через гемодиализатор. Пример 3. Очистка К 2 Р из Е.Со. 1. Очистка К 2 Р из Е.Со путем аффинной хроматографии на ЕТ-сефарозе после предварительного концентрирования. а) Элюирование с помощью лимонной кислоты. Смесь после ренатурирования концентрируют через Ме-диализатор ( АМ 300) 123 и дополняют с помощью 0,5 ммоль/л аС 1. Уравновешенную с помощью 0,1 ммоль/л Трис-НС 1, рН 7,5, 0,8 ммоль/л аргинина, 0,5 ммоль/л аС 1 колонну с ЕТ (эритрина-трипсин-ингибитор)-сефарозой (объем 50 мл) нагружают 550 мл концентрата подвергнутой повторному окислению смеси (10 колоночных объемов /час. 10(час) и промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока абсорбция элюата при 280 нм не достигнет холостого значения буфера. Элюирование связанного материала осуществляют с помощью 20 ммоль/л лимонной кислоты, рН 3,2. объем активность Спрот мг/мл 1/ мл/мг Концентрат 550 57.162 14 4,083 ЕТ-элюат 90 330. 000 0,71 465,000 1) Удельная активность, активность в хромогенном тесте (см. пример 4 б) разделена по содержанию протеина в пробе. б) Элюирование с помощью 0,3 ммоль/л аргинина рН 4,5. Ренатурированную реакционную смесь концентрируют как описано в примере 3.1.а. (Уравновешенную с помощью 0,1 ммоль/л Трис 1 7,5, 0,8 ммоль/л аргинина, 0,5 ммоль/л) 1 колонну с -фзй (25 мл) нагружают 800 мл концентрата (12/час) и промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока экстинкция элюата при 280 нм не достигнет экстинкции буфера. Связанный материал элюируют с помощью 0,3 ммоль/л аргинина, рН 4,5. объем активность Спрот/мг Концентрат 800 20,000 11,3 1170 ЕТ-элюат 55 280,000 0,6 550,000 2. Очистка К 2 Р из . путем аффинной хроматографии на ЕТ-сефарозе без предварительного концентрирования. 6 2120 1 Уравновешенную с помощью 0,1 ммоль/л Трис-1, 7,5, 0,8 ммоль/л аргинина, 0,5 ммоль/л 1 колонну с -фозой (объем 10 мл) загружают 12 л повторно окисленно смеси и промывают уравновешивающим буфером до тех пор, пока экстинкция элюата при 280 нм не достигнет экстинкции буфера. Элюирование связанного материала осуществляют с помощью 0,8 ммоль/л аргинина, 5. объем активность Спрот/мг Повторно окисленная смесь 12.000 615 0,135 544556 25 ЕТ-элюат 42 105,000 0,185 568000 35/ стимулирование путем фибринаактивность в присутствии фибрина отдельно от активности без фибрина. Пример 4. Характеристика очищенного К 2 Р из .со. а) Протеин-химическая характеристика.-РАЕ и обратная фаза жидкостной хроматографии высокого давления. Гомогенность очищенного с помощью аффинной хроматографии с ЕТ сефарозой материала показана благодаря -РА и обратной фазы жидкостной хроматографии высокого давления ( Р-НР). Из относительной длины пробега рассчитывается для К 2 Р из прокарионтов молекулярный вес 38.5002.000 Да. Денситометрическая оценка дает чистоту препарата выше 95.Р-НР С основана на различном взаимодействии протеинов с гидрофобной матрицей. Это свойство используется в качестве аналитического метода для квалификации степени чистоты. Анализ очищенного К 2 Р из Е.со осуществляют через разделительную колонну с Нуклеозилом 300 с помощью градиентов трифторуксусная кислота (ацетонитрил) буфер А 1,2 мл трифторуксусной кислоты в 1000 мл воды буфер В 300 мл воды, 700 мл ацетонитрила, 1 мл трифторуксусной кислоты 0-100 Интегрирование хроматографического анализа дает чистоту выше 95.-Терминальная последовательность аминокислот определяется с помощью АВ 470 - секвенатора со стандартной программой и линейным РТН-детекрированием. Найденная последовательность -2-3-45-6-7-С 8-9 совпадает с ожидаемой, происходящей из ДНК-последовательности, последовательностью. б) определение активности. Ин витро активность К 2 Р из Е.со определяется по описанию теста в 42 (17) 478-486 (1987). Удельная активность составляет 550.000 /мг 200.000 /мг. Стимулируемость К 2 Р из Е.со благодаря-фрагментам фибриногена (активность в присутствии фибриногеновых фрагментов отдельно от активности без фибриногеновых фрагментов) в этой тест-системе составляет более 25. в) ин витро-связывание с фибрином. Ин витро-связывание К 2 Р из Е.со с фибрином определяют по описанномуиметоду. ( , (1987), ., 26, 7786-7791). На рис. 2 показано, что К 2 Р из Е.со в противоположность -РА из СНО или -РА из Е.со не обладает никаким достойным внимания фиориновым связыванием. Пример 5. Для увеличения выхода экспрессии кодирующую К 2 Р-ген последовательность переклонируют в плазмид с более высоким числом копий. Для этой цели используют плазмиду реРа 126.1, описанную в патенте ФРГ 38 38 378.0. Эта плазмида составляется главным образом из вектора рКК 223-3 и кодирующей последовательности для -РА, как описано в европейском патенте А-0 242 835. В эту плазмиду прежде всего интегрируют последовательность -терминатора. Для этой цели плазмиду реРа 126.1 линеаризируют с помощью рестрикционного фермента . Таким образом расщепленную плазмиду разделяют с помощью гель-электрофореза и получают препаративно. Плазмиду( и др.(1978), .., 5, 4495-4503 и др. (1981),78(8) 4963) подвергают рестрикции с помощьюи препаративно получают величиной примерно 360 вр -фрагмент, который содержит терминат, путем гель-элетрофореза и гель-элюирования. Линеаризированный плазмид реРа 126.1 и длиной 360 вр-фрагмент излигируют. Смесь после лигирования котрансформируют с описанной в заявке на патент ФГ 38 38 378.0 плазмидой р 500 в . 2102. Из клонов выбирают те, которые содержат желательную плазмиду 126 , которая отличается от исходной плазмиды реРа 126.1 тем, что она содержит второе место разреза. Из плазмиды реРа 126 получают два фрагмента величиной 3,4 кв(Р- фрагмент и величиной примерно 1,3 кв )-фрагмент. Оба указанных фрагмента лигируют с помощью величиной примерно 1,3 кв(-фрагмента из плазмиды рА 27.3 и трансформируют в . с помощью плазмиды 500. Результирующая плазмида получает название рА 27 и может отличаться от реРа 126. с тем, что у 2120 1 подвергнутой рестрикции смеси с помощьюимеется второй очень маленький-фрагмент из реРа 126 длиной примерно 610 вр в рА 27 , сокращенный примерно на 515 вр. Пример 6. Фармакологические данные экспримированного в прокарионтах -РА-производного К 2 Р. 1. Фармакокинетика К 2 Р на кроликах. К 2 Р на белых новозеландских кроликах сравнивают спо их фармакокинетическим свойствам. Оба фибринолитика настаивают в дозе 200 000 /кг К в течение 30 минут. Пробы плазмы получают в определенные моменты времени до, во время и после вливания. -РА-Активность измеряется с помощью спектрофотометрического теста по и др. . , 48, 266 (1982 модифицированному по . /. . /пп Ме 42, 478 (1987. Для расчета фармакокинетических параметров используют расчетную программу нелинейной регрессии,модифицированную по 64,, 1-30, 1969). Параметры рассчитывают индивидуально с помощью биэкспоненциальной фармакокинетической модели. К 2 Р показывает в пять раз более длительное время полураспада (1/2 10,3 мин., уменьшение концентрации в плазме), чем(-РА-препарат фирмы(таблица 1, рис. 5 и 6). По окончании вливания/мл, которая таким образом в шесть раз выше, чем в случае . Распределительный объем центрального отделениясоставляет для К 2 Р 46,8 мл/кг по сравнению с 73,7 мл/кг для . Клиренс всей плазмы (Собщ.) по сравнению с(Собщ. 22,2 мл/мин/кг) в случае К 2 Р-Ро снижен на 1/7(Собщ.3,2 мл/мин/кг). Для применения фибронолитика для инъекции пилюли особенно интересна область под кривой (АС), так как она допускает сравнение концентрации, главенствующей во времени в плазме. К 2 Р показывает АС в 8 раз выше (1064 1/мл.час) чем А (133.3 /мл.час). В целом, К 2 Р по сравнению св настоящее время единственный продажный рекомбинантный РА-протеин, при равной дозе показывает улучшенный в 5-8 раз фармакокинетический профиль. 2. Фармакодинамика К 2 Р на кроликах. Для испытания тромболитической эффективности используют основанную .и др. модель на кроликах по тромбозу яремной вены (., 71, 368, 1983). К 2 Р иисследуют в трех, смотря по обстоятельствам, дозах. Фибринолитики вливают в течение 4-х часов и затем определяют скорость тромболиза (таблица 2, рис. 5). Рассчитанная с помощью линейной степени регрессии доза для скорости тромболиза 50 (ЭД 50) составляет, для К 2 Р 124.000 /кг К и для 520.000 /кг К, К 2 Р показывает, таким образом, в 4 раза более высокое тромболитическое действие, чемК 2 Р достигает, в зависимости от дозы, концентрации в плазме, активности -РА, которая при четырехкратно сниженной дозе сравнима с . Сравнимая по тромболитическому действию с 800 к /кг -доза в 200 к К 2 Р/кг К приводит к незначительным воздействиям на параметры получения фибриногена, плазминогена и 2-антиплазмина,которые, однако, не отличаются от воздействий дозы 800 к /кг К. К 2 Р представляет собой -РА-утеин, который на модели тромбоза яремной вены кролика при четырехчасовом вливании фибринолитиков при понижении дозы на 1/4 дозыпроявляет такое же тромболитическое действие, как и , К 2 Р не отличается при пониженной дозе отпо воздействиям на систему свертывания и по концентрации в плазме -РА-активности. Пример 7. Фармакологические свойства К 2 Р из Е.со на используемй в качестве модели собаке с тромбозом коронарной артерии. Для того, чтобы изучить тромболитическое действие К 2 Р из Е.со на артериальных тромбах, в качестве примера выбрана экспериментальной моделью животное с острым инфарктом миокарда. В качестве вида животных исследовали собаку. Метод образования тромба коронарной артерии представляет собой модификацию способаи др. (. . 17, 841 (1980). В открытой грудной клетке в случае находящихся наркозом и при искусственном дыхании собак электрически раздражают поверхности интимы окружающей ветви . (150) и благодаря этому возникает тромбоз. Дистально тромбоз прежде был вызван спиралью, чтобы удалить путем экспериментального стеноза реактивную гиперемию. Проксимально коронарный тромбоз прежде был вызван спиралью, чтобы удалить путем экспериментального стеноза реактивную гиперемию. Проксимально коронарный тромбоз был инструментирован СХ с электромагнитной плавающейизмерительной головкой, чтобы можно было измерять реперное слияние. При изучении нахождения доз находящимся под действием гепарина собакам в течение 1 минуты вводили путем иньекции ВМ 06.022 с эукариотным -РА (,и др.ГмбХ, , ФРГ) в виде четырех различных доз, и с плацебо, смотря по обстоятельствам, 6-ти животным на дозу в виде внутри 8 2120 1 венной одноразовой начальной пилюли. До и в определенные моменты времени после инъекции получали пробы плазмы, чтобы определить концентрацию в плазме -РА-активности и фибриногена, плазминогена и 2 антиплазмина, а также, чтобы определить число тромбоцитов во всей крови. Фибриноген измеряют коагулометрически по Клаусу ( ., 17, 237, 1957), плазминоген и 2-антиплазмин измеряют, как описано уи др.) . . . 71. 368. 1983), спектрометрически. Таблица 1 Фармакокинетические параметры, полученные из компьютерных расчетов концентрации -РА в плазме временные данные на основе -РА-активности Средство/ доза 200000 /кг К 2 Р (4) Таблица 2 Тромболиз, уровень активности - в плазме по окончании вливания в течение 4-х часов/ и параметры гемостазиса(30 минут по окончании вливания) К 2 Ри растворителя-РА-активность плазмы /1./мл/ 93718,2 443 70 10727 фибриноген 742 906 86,56 923 776 плазминоген 792 756 8711 9810 774 2-антиплазмин 701 704 934 988 746 к 1000 патраметры гемостазиса , рассчитанный на основную линию). Далее,время кровотечения измеряли на задней ноге собаки с помощью стопора (защелки),, , ФРГ) во время застоя 40 мм(. . , 27, 244, 1979). Статистическое сравнение измеренных величин после инъекции с контрольным значением до инъекции осуществляют с помощью тестадля разниц пар. Для того, чтобы можно было описать тромболитический успех, указывается число обоснованных репером на дозе-группа животных (скорость слияния реперов), а также время вплоть до слияния реперов (время слияния реперов). Далее, определяют мокрый вес еще имеющегося спустя 2 часа после инъекции остаточного тромба, и определяют количество животных с новой закупоркой после слияния реперов ( скорость повторной окклюзии). С помощью полулогарифмического регрессионного анализа действия доз (отношение скоростей слияния реперов) для каждого вещества рассчитывается эффективная доза для 50-ной скорости реперного слияния (ЭД 50). Статистическое сравнение веса остаточного тромба осуществляют с помощью тестаМапп- для несвязанных проб на выдержку. Концентрация в плазме -РА-активности измеряется с помощью спектрофотометрического теста пои др. (. ., 48, 266, 1982), модифицированного по /,. , 42, 478, 1987). Для расчета фармакокинетических параметров используется расчетная программа нелинейной регрессии, модифицированная по Н.У.(- , 64,, США, 1-30, 1969). Параметры рассчитываются индивидуально после снижения свойственного организму базального уровня -РА-активности нижеследующих измеренных значений с помощью би-экспоненциальной фармакокинетической модели. Получаются следующие результаты 1. Фармакодинамика на собаке. К 2 Р после внутривенной инъекции приводит к зависящей от дозы скорости слияния реперов. Максимальный эффект (скорость слияния реперов 100) достигается после инъекции 200 к/кг К. Доза со 100 успеха слияния реперов в случаесоставляет 1600 к/кг К. Сравнение значений ЭД 50 для К 2 Р (ЭД 5083 к/кг К) дает сниженное в 11,5 раз значение, чем для(ЭД 50961 к/кг К). Введение плацебо на ведет ни к какому 9 2120 1 слиянию реперов. Вес остаточного тромба у животных с введенным плацебо составляет 9,61,1 мг (среднее значение ЕМ) как К 2 Р, так и такжеприводят с увеличением доз к статистически значительному снижению веса остаточного тромба по сравнению с плацебо-контролем. Слияние реперов происходит в случае обоих фибринолитиков в среднем у всех животных спустя 25,93,5 мин (К 2 Р), соответственно, спустя 24,26,2 мин . Большинство обработанных К 2 Р илисобак повторно окклюдируют после слияния реперов (таблица 3). 2. Фармакокинетика на собаке. После внутривенной инъекции 200 к/кг К 2 Р илина наркотизированной собаке показано, что быстрая фаза уменьшения концентрации в плазме, выраженная в виде 1/2 в случае К 2 Р с 7,21,1 мин на фактор 4,5 длиннее, чем в случаес 1,60,2 мин (таблица 4). Найденная непосредственно после окончания инъекции концентрация в плазме К 2 Р примерно вдвое выше, чем в случае А. Удаление К 2 Р из плазмы (клиренс плазмыСобщ.) осуществляется в девять раз медленнее, чем в случае с. Соответственно, площадь под кривой концентрации в плазме К 2 Р примерно в 9,5 раз больше, чем таковая в случае . 3. Специфичность фибрина на собаке. Спустя 2 часа после инъекции К 2 Р находят зависящее от дозы в небольшой степени снижение остаточной концентрации фибриногена до 8110 в случае самой высокой дозы (200 к/кг К). В противоположность этому концентрация фибриногена после введения самой высокой дозы(1600 к/кг К) почти полностью снижена до 30 (таблица 5). Если осуществляют полулогарифмический регрессионный анализ доза-побочное действие (соотношение снижения фибрина) и определяют тромболитическое для ЭД 50 действие в отношении остаточной концентрации фибриногена, то для эквипотентных доз в случае К 2 Р остаточное содержание фибриногена получается 92,5 по сравнению с 38,6 в случае . Также для плазминогена и 2-антиплазмина находят зависящее от дозы снижение остаточного содержания спустя 2 часа после инъекции, которое в случаеболее ярко выражено, чем в случае К 2 Р. Лишь концентрация тромбоцитов в случае обоих веществ почти не затрагивается. 4. Влияние на время кровотечения у собаки. Внутривенная инъекция К 2 Р не дает никакого статистически значительного удлинения времени кровотечения по сравнению с контрольным значением перед инъекцией во всех 4-х различных дозах. В противоположность этомув дозах 1130 и 1600 к/кг К статистически значительно удлиняет время кровотечения (рис. 6 и 7). 5. Общая оценка. На описанной модели-собаке тромбоза коронарных артерий К 2 Р показывает себя как тромболитик, который после внутривенной инъекции пилюлиможет достигать 100-ной скорости слияния реперов,не влияя сильно на концентрацию фибриногена и без заметного удлинения времени кровотечения. По сравнению св качестве уровня техники К 2 Р в тромболитической потенции после внутривенной инъекции пилюли оказался отчетливо превосходящим (фактор 11,5). Исследование фармакокинетического профиля К 2 Р, далее, дает, что по сравнению склиренс К 2 Р, как выражение для более продолжительного удаления из плазмы, в девять раз длительнее. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66. 12