Способ получения лейкоцитарных интерферонов человека

Изобретение относится к области технологии рекомбинантных ДНК, тДе.П р н м е р. Используют два микроорганизма Е.со 11 к 1776 и Е.со 11 К-12 штамм 29 д (конец А.Ь 1 лег,Ьзт) .МРНК лейкоцитарного интерферона человека (Ье 1 Р) получают из лейкоцитов человека, взятых у-больных хронической миелогенной лейкемией. Таковыми являются линия клетокд обозначенная КБ-1, полученных от пациентов с.острой мнелогенной лейкемией.У КС 1 клеток индуцируют продукцию лейкоцитарного интерферона МРНК с помощью вирусов Сендай или Ньюкаст-20 ла. Клетки собирают 5-ч спустя после индуцирования и РНК приготовляют по методике с применением гуанидин 7 тиоцианат-гуанидингидрохлорнда. Для получения 12 8 фракций полн (А) МРНК используют олигодеокситимидин а Т-целлюлозную хроматографиюи санарезное градиентное ультрацентрифугипование.5 мкг мРНКиспользуют для получения двойной цепочки КДНК по цепочечной методике Указанные КДНК фракционируют по размерам с помощью электрофореза на 6-ном полиакриламд ном геле и 230 иг материала с разме 10рами в интервале от 500 до 1500 вдп. 35 выделяют электроэлюированием. 100 нг этой кДНК присоединяют к деоксицитидиновым остаткам (ос) И реденатурируют с д 70 нг плазмид рН К 322 кото- 40рые были соединены с деоксигуанозиновымн (ас) остатками по (Рас 1) сайтуи используют для трансформации Е.со 11 и 1776. Получают устойчивые к тетрациклину, чувствительные к ампициллину 45 трансформанты. Синтезируют четьше набора дезоксиолигонуклеотидных зондов для каждой последовательности,содержащие три (Т-1 А В, С, В) илиМРНК полунают из 12 8 РНК, КС-1 индуцированных вирусом Сендай либо целиком поди (А) мРНКз неиндуци рованнык лейкоцитов. Р-меченные 55КДНК готовят известным способом. Немеченный продукт выделяют с помощью гельфильтрации на лонке, заполненной 10 мл Сефадекс С-50, обработан 15Для идентификации кленов рЪ 1-рЪ 30 используют быстрый процесс изолирования плазмиды по Вирнбойму.При этом получают 1 мкг плазмиды ДНК из каждых 500 индивидуальных трансформантов Е.со 11 К-12 штамма 29 н. Каждый образец ДНК денатурируют и наносят на нитроцеллюлозные фильтры в трех экземплярах, следуя методике Кафатоса с сотр. (см. выше).Три группы нитроцеллюлознык фильтров, содержащих 500 образцов плазмид, гибридизируют со стимулированной кЦНК, заложенной с Т 1 группой носителей информации (праймеров) Т-13, заложенной стимулированной КДНК нестимулированной кДНК,приготовленной с использованием обеих групп носителей информации.Клоны считают положительныи если они гибридизируют сильнее один или оба зонда стимулированной кДНК чем полностью иестимулированный зонде Было отобрано 30 положительных клонов (рЪ 1-рЪЗ 0) из 500 для дальнейшего анализа..Трансформанты Е.со 11 и 1776 скри днируют по методике гибридизации ко лоний используя в качестве зонда эиг-меченную стимулированную НРНК. Немечениую МРНК из нестимулированных клеток смешивают с зондом присоотношении 20 От 1 для конкуренции с неимулировзнной МРНК, имеющейся вР-меченном препарате. Гибридизация меченой мРНКбупет происходить предпочтительно в колониях, содержащих Р стимулированные последовательности. Получают три класса трансформантон 2-32 колоний, гибридизованных 32 МРНК очень сильно 102 гибридизован нык значительно меньше, чем 1-й класс остальное, не дающее определимы сигнал гибридизации.(классы 1 И 2) на наличие интерферон-специфических последовательностей с помощью анализа, который зависит от гибридизации интерфероноаой МРНК конкретно в плазмнду ДНК. Первоначально вьшащивают индивидуально 60 сильно положительных колоний10 культур н изолируют плаемиду ДНК 1 п(1970). 10 мкг каждого пула плазмщды ДНК расщепляют Нйпе 111 деиатурируюти ковалентно связывают сДБМ (диазо- 151 бензилоксиметиловой) бумагой. На каждом фильтре гибридиэрют 1 мкг очищенной мРНКиз стимупнрованныхкле.ток Негибридизованную МРНК удаляютмент, обозначенный Ье 1 Н 1, очень похожийна Ъе 1 Е Н. Полученные гибридные плазмиды обозначают рЪЕ 1 Г Н и т,п.Готовят плазмиду ДНК из всех 39 потенциальных Ъе 1 Р кДНК клонов и проводят повторный скрииинг с тем же 260 в.р. ДНК зондом, используя проЦедУрУгнбриднзации Кафатоса с сотр.промывной. Специфически гибридизоваи- 20 ную МРНК элюируют итранслируют в со циты личинок Хепорцв. По этой пробе все 6 пулов были отрнательныи.из 9 колоннй делают из 59 слабо поло- 25жнтельных.колони (класс 2), Готовит плазмиды нэпулов и исследуют, как 0 описано выше. Среды 6 тестированныхпулов был тестирован один (к 10), гибридизованныв,интерфероинуюмНК Рр при условии значительно вынь исход ных уровней каждого времени. Для того, чтобы определить специфически интерферонный кднк-клон готовят плаз-1 мды ДНК из 9 колонн пула К 10 и исследуют индивидуально, Две из девятиплазмид (0101 и Ш 104) связывают интерфероннущсмРНК существенно лучше,чем при указанны исходных уровнях.ВЕ 1 11 рестрикционный фрагмент, со держащий 260 в.р. меченны 51 с использованием.процедуры, описанной Тейлоромрс.сотраиспольвцртвкана. стве зонда для независимого скрининга 400 Есо 11 290 трансформантов с помощьюпроцедуры скрининга колонийИдентифиируют 9.колонн (рЪ 31 ръ 39), которые гибридизуют до различной степени с этим зондом.кроме того, используют меченный 260 в.р. фрагмент для независимого скрииинга 4000 Е.со 11 294 трансформентов таки не образом. Индентифн-цируют 50 колоний, которые гибридизуют до раэличнойстепени с этим зондом. 0 днасодержит Ье 1 Г С-фрагмент,одна Ье 1 Р Нфрагмент и одна - фраг 30с использованием а 1 Рмеченных синтетическихундекамеров (индивидуальные Т-1 первичные пулы праймеров информации или индивидуальные Т-13 праймеры информации) непосредственно в качестве гибридизующин зондов. Условия гибридизации выбирают.таким образом,что для определиы сигналов гибридизации должны требоваться точно спаренные основания. Следовательно,плазммда ДНК из-Зьклоиов была приготовлена по стандартной процедуре очищения лизата (Клевелл с сотр.,см. выше) и очиена колонной хроматографией на Биорад Агарозе А 5 О. Образцы по 3 мкг каждого препарата делают линейными обработкой Есо К 1, денатурируют в щелочи и наносят на 2 отдельныиитроцеллюлозных филь тра по 1,5 мкг на пятно (Кафатос с соСдтгор См. выше). Фосфорилируют индивидуальныесинтетические деоксиолигонуклеотидиые праймеры информации и пулы ираймеров информации с помощьюгфией в колонках с 10 мл Сефадекс С-50. Гибрндизации осуществляют с использованием 10 рсрм пула праймеров Т-13 С или З-105 срм пула прайме ре Т-1 С при 15 С в течение 1 д ч в Бн ЗЗС (1 х 85 С 0,15 М НаС 1 0,015 М лионнокислого натрия, рН 7,2, 1 Ох раствор Денхардта (0,2 бычьего сывороточного альбумна, 0,22 поливи 5 . мною с 6ннлпиролндона 0,22 фиколла). Фильт ры промывают 5 мин ( раза) при 0 С Бк БЗС, сушат и облучают на рентгеновской пленке При этом плазмида ДНК из клонас пулом праймеров информации Т 1 С и праймеров информации Т 1 ЗС, но не дает определимой гибридизации с други тми ундекамерамн. Несколько из 39 по тенциальных-Ъе 1 Е плазмид (ръ 2 д 1 З 172 О,30 З 1,ЗА) также гибридизуют с обоими этии зондами. Рас 1-усвоение ръ 31 показывает размер кДНКвставки,которы должен составлять примерно 1000 в.р.Найдено, что первы АТСтрансли рующий начальный кодон состоит изтельности и затем 188 крдоновпосле ТСА концевого триппетаимеетея 342 нетранслируемых нуклеотидов у З конца, следующих на поли-(А)гпоследова-У тельиостью Путативный сигнальный пептид (по-видимому, включенный в секрецию готового Ъе 1 Е-из лейкоцитов) имеет длину из 23 аминокислот. 165 аминокислот,составляющих готовый Ъе 1, имеют рассчитанны молекуляр ный вес 19390, Ъе 1 Г, закодированный рЪ 31 обозначают Ъе 1 А. ЗАП ЗА рестрикционный вндонуклеаэный участокрасположен между кодонами 1 и 3 сэРА.Два синтетическим деоксиолигонукле отида включают АТСтранслирующй нат чальныйкодон,реконструируют кодон амнокислоты 1 (цистеин) и создают Есо П 1 липкий конец. Эти олигомеры были связаны в 34 в.р. ЗАП 3 аА-а 11 фрагмент.рЪ 31. Полученный в резуль тате 45 в.р. продукт лигируют в два дополнительных фрагмента ДНКдля конструирования 86,5 в.р. синтетическогорыл кодирует ЪШЕ Аикоторый связывается Есо К 1 и Рай-1 (рестрикционны ми участками). Такой ген включают в. рп Ц 322 между Есо К 1 и Рас 1 участками для получения плазмидыРЪ 1 Е А 1. Конструкция триптофанового-контролънотс элемента, содержащего д р рЕ.со 11 стр промотор оператор и стрлидер рибосомсвяаывающего участка,но не содержащего АТС-последователь НОСТИ ДЛЯ НННЦИИРОВЗНИЯ транслнцигцрПлазмщдарСМ 1 несет триптофановый оперои Е.со 11, содержащий делецию ЬЬ Е 1413 н экспрессирует протеин, 50включающий первые 6 аминокислот стр лидера н приблизительно последний-третий сгр Е полипептид (позже упо минаемый в сочетании как ЪЕ-3, а также игр В полипептид в его целос ти все под контролем системы ггр промотор-оператор. Плазмиду (20 мкг) обрабатывают рестрикционным ферментом РЧП 11, который расщепляет плазмиду на пять участков. Генные фрагменты затем комбинируют с линкерами Есо В 1, состоящии из самокомплиенг тарного олигонуклеотида с последовательностью рСАТ 0 ААТТСАТС,обеспечие вая Есо В 1 участок расщепления для последующего клонирования в плазмиду, гнык из р 0 М 1, 10 ед. ТдДрКлигазы в присутствии 20 О пкмолъ 5 7 фосфорнли рованного синтетического олигонуклеотида рСАТСААТТСАТС и в 20 мклдитиотрейтола)при дС в течениеночи. Затем раствор нагревают 10 мин при 1 7 ОС до прекращения лигацииу-Связки отщепллют перевариванием Есо В 1 и фрагменты, теперь с концами Есо К 1,отделяют-используя электрофорез наИ при наиболее широких фрагментах выделениы из гели первым пятном с этидиумбромидом, локализун фрагменты ультрафиолетовы светом и выре-Увают из геля интересующие участки. помещают каждый гелевй фрагментс 300 мкл 0,1 ТБЕ в диализаторнй бачок и подвергают злектрофорезу при 100 В в течение часа в 0,11 ТБЕбуфере(ТБЕтбуфер содержит 10,8 г трнсос нования, 5,5 г борнойкйслоты, 0,09 г Ыа 1 ЭДАТУК в 1 л воды).Водный раствор собирают из диалзаторного бачка, экстрагируют фенолом, р экстрагируют хлороформом, делают 5,70,2 М раствор клористого натрия И . извлекают ДНК в воде после осаждения этанолом, содержащий ген стр промптороператор слипки концами Есо К 1 идентифицируют по указанной ниже процедуре, которая вызывает вставление фрагментов в чувствительную к тетрациклину плазмиду,которал при вставлении промотороператора становится устойчивой к тетрациклину, Плазмида рВВН 1 экспрессирует ан- пициллиновую устойчивость и содерЖНТ ГЕН УСТОЙЧИВОСТИ К тетрациклину.фермент экстракцией фенолом с последУющейзкстракциейхлороформоми со- 10 р бирают в воде после осаждения этано лом. Полученную в результате молеку лу ДНК в отдельных реакционных смесях, объединяют скаждым из трех фрагмен тов ДНК, полученных выше, и лигируют 15Используют ДНКнакодящуюсив реакционной смеси, длятрансформации Е.со 11 К-12 штамма 294 по стандартной мето днке и бактерии помещают на ЬВ 20 о(Ьит 1 аВетЬап 1)-пластины,содержащие 20 мкгЙл ампицилпина-и 5 мкг/л тетрациклина. Отбирают несколько устойчи вым к тетрациклину колоний, изолируют-плазмидуДНКи доказывают наличие же 25даемого-фрагмента с помощью рестрикционного ферментного анализа Полу-ченную плазмнду обозначают рз КН ттр.гепатита В получают традинонным способом и клоиируют в Есо В 1 и Ваш.Н 1 унастки,ппазмиды р С Н 6 для образования плазмиды рн 5 32.Затем чВ 1-Таз 1-фрагментом триптофанового оперона (0,01 мкг) происходящего из рВ КН стр. В способе легировании фрагмента из рН 8 32 к-фрагментуХ Ъа 1, хотя он не совершенно спареи основанию Уатсона-Крика-Е - СТАСА - -ТСТАСА - часе тот - АССТСТ Часть этой лигационной реакционной294, проводит термообработку и помещают на пластины ЪВ, содержащие ампицнллин. Отбирают 24 колонии, выра.щивают в З мл ЪВ (Луриа-Бертани) среды и изолируют плазмицу. Найдено, что 6 из них иеют ХЪа 1-участокре ренерированны с помощью Е.со 11, ка тализированной ДНК повторным спариванием и репликацией .- АБСТСТ - - АСАТСТ Найдено, что эти плазмиды расщепляются как Есо К-1, так и Нра 1расщепляют плазмиду рН 5 32 с помощью 35 ртгр 14 используют для экспрессии-нхейм) в 30 мкл полимеразного буфера до3 - т 3 Два нуклеотида, ас и ат, бьши вклчены и дали конец с двумя выступающм вперед 5 нуклеотидами. Такой лмнейнй остаток плазмиды рН 5 32(после экстракции фенолом н хлорофррмомгтсбора в воде после осаждения этанолом) расщепляют Есо Н 1, отдепн-. ют широкий плаамидный фрагмент от меньшего Есо В 1-КЪа 1 фрагмента с по ТСТ 56человеческого гормона роста (ЧГР), составленный из 23 аминокислотныхкодовое, полученных из синтетических ДНК-фрагментов, и 163 аминокислотных кодонов, полученных из комплементарной ДНК, полученной с помощью обрат.иой транскрипции информационной РНК. 37 С. Такая обработка приводит к за-к 45 ЧГР. Этот.геи котя в иемотсутству-люткодоиы рте последовательности ЙЧГР, содержит АТС-транслирующий начальный кодон. Этот ген изолируют изВ 1 с последующей обработкой Е.со 11 ДНК полиеравой Кленоза фрагмента и6 ТТР и а АТР как указано еще. Пос пе экстракции фенолом н хлороформом И осаждения этанолом ПЛЗЗМНДУ обрабатывают Ваш Н 1.Фрагмент, содержащий ген ЧГР изо лируют с помощью ПАГЭ с последующим электроелюированием. Полученный в ре вультате ДНК-фрагмент также содержит