Штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum для получения пробиотического препарата

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ШТАММ БИФИДОБАКТЕРИЙДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Ижик Анастасия Владимировна Новик Галина Ивановна Сидоренко Анастасия Вячеславовна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(56)2048517 1, 1995. НОВИК Г.И. и др. Сельское хозяйство проблемы и перспективы Сб. научн. трудов. - Т. 1. - Ч. 2. - Гродно, 2003. С. 342-343. НОВИК Г.И. и др. Сельское хозяйство проблемы и перспективы Сб. научн. трудов. - Т. 1. - Ч. 2. - Гродно, 2003. С. 343-346. НОВИК Г.И. Проблемы микробиологии и биотехнологии. Материалы международной конференции. Минск, 1998. - С. 69-70.2210592 1, 2003.2308483 2, 2007.(57) ШтаммБИМ В-476-Д, обладающий антибиотикорезистентностью, для получения пробиотического препарата. Изобретение относится к микробиологии и биотехнологии и представляет собой штамм бифидобактерий, обладающий антибиотикорезистентностью, содержащий в составе клеточной стенки биологически активные липидные компоненты, перспективный для использования при производстве пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов. Бактерии родашироко используются в качестве основы пробиотических препаратов и диетических продуктов питания, предназначенных для лечения и профилактики дисбиотических состояний желудочно-кишечного тракта, стимуляции иммунной системы и нормализации обмена веществ 1, 2. Дисбиотические состояния широко распространены, имеют тяжелые последствия для здоровья, поэтому препараты для коррекции нарушенной микробиоты занимают одно из ведущих мест в комплексной терапии и профилактике заболеваний, при которых регистрируется дисбиоз 3-5. Пробиотические микроорганизмы, кроме таких свойств, как способность оставаться жизнеспособными при прохождении через ЖКТ (устойчивость к действию желчных кислот,соляной кислоты и панкреатических ферментов), способность к адгезии с эпителием слизистой кишечника, синтез антимикробных веществ против патогенных микроорганизмов,возможность колонизации кишечника или соответствующего органа-мишени, безопасность применения у человека, клинически доказанная польза для здоровья, должны обла 18510 1 2014.08.30 дать такими признаками, как сохранение жизнеспособности при длительном хранении и устойчивость к антибиотикам, применяемым в клинической практике 6. Известны штаммы бифидобактерий, которые широко используются для производства пробиотических препаратов и кисломолочных продуктов 7-9. Общим недостатком перечисленных штаммов является отсутствие резистентности к антибиотикам нового поколения. Результаты микробиологического исследования, в ходе которого проводилось изучение чувствительности пробиотиков, входящих в состав ряда молочных продуктов и лекарственных препаратов (34 штамма.,. и 21 штамм бактерий, использующихся для ферментирования молочных продуктов (закваски, показали, что пробиотические микроорганизмы чувствительны к большинству групп антимикробных препаратов 10. Наиболее близким из аналогов заявляемого изобретения является штамм-5813 из Всесоюзной коллекции культур промышленных микроорганизмов ВНИИ генетика (прототип) 11. Недостатком данного штамма является отсутствие резистентности к антибиотикам широкого спектра действия, сведения о других полезных свойствах штамма отсутствуют. Целью данного изобретения является получение нового штаммаБИМ В-476-Д, обладающего резистентностью к различным антибиотикам нового поколения, а также рядом полезных свойств (стабильность при хранении, продукция биологически активных липидов). Для получения штаммаБИМ В-476-Д была проведена селекция штамма 379. Селекция проводилась без использования химических и физических мутагенных факторов и генно-инженерных методов посредством длительной адаптации штамма к постепенно увеличивающимся концентрациям антибиотиков в среде культивирования. Как антимикробные агенты были взяты антибиотики нового поколения различной химической структуры 1. Кларитромицин (макролиды) - блокирует биосинтез белков, связываясь с 50-субъединицей рибосом. 2. Азитромицин (азалиды) - угнетает пептидтранслоказу. 3. Тримоксазол (сульфаниламиды) - блокирует синтез фолатов в клетке. 4. Ципрофлоксацин (хинолоны) - угнетает ДНК-гиразу, нарушая синтез ДНК. 5. Метронидазол (имидазолы) - ингибирует синтез нуклеиновых кислот. 6. Амоксициллин (пенициллины) - угнетает транспептидазу, вызывает лизис клетки. Для культивирования бактерий использовали модифицированную среду МРС 12 следующего состава (г/1 л дистиллированной воды) пептон - 10, мясной экстракт - 10,дрожжевой экстракт - 5, лактоза - 10, глюкоза - 10, 24 - 2, аммоний лимоннокислый 2, натрий уксуснокислый - 5, 472 - 0,4, 452 - 0,08, -цистеин- -0,5,твин-80 - 1, агар - 1. Бактерии выращивали при температуре 371 С в течение 18-24 ч. В результате селекции получен антибиотикорезистентный штамм бактерийБИМ В-476-Д, способный к росту при высоких концентрациях антибиотиков различного действия в среде культивирования. Приобретенный признак сохранялся при поддержании штамма на питательной среде МРС ( 7,0) при длительном (более 6 месяцев) хранении. Заявляемый штамм депонирован в Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (Научная коллекция типовых и промышленно-ценных непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси). Таксономическая принадлежность. Штамм был идентифицирован какна основании совокупности морфологических, культуральных и физиологобиохимических признаков согласно определителя Берги. Культурально-морфологические признаки. Клетки штамма представляют собой грамположительные, неспорообразующие, неподвижные, прямые или слегка изогнутые палоч 2 18510 1 2014.08.30 ки с булавовидными утолщениями на концах, расположение клеток в мазке одиночное,парное, -или -образное. При глубинном посеве в полужидкую среду растут по всей толщине столбика за исключением зоны аэробиоза величиной 0,5-1,0 см. При посеве последовательных разведений образуют мелкие белые колонии диаметром 1-3 мм в форме гречишных зерен, гвоздиков или комет. Физиолого-биохимические признаки. Каталазы не продуцирует, нитраты не восстанавливает, желатин не разжижает, пигмент не образует. Факультативный анаэроб. Ферментирует глюкозу, фруктозу, галактозу, лактозу, ксилозу, мальтозу, раффинозу,арабинозу, сахарозу. Не сбраживает целлобиозу, маннозу, трегалозу, маннит. Глюкозу ферментирует до уксусной и молочной кислот без образования газа. Оптимальная температура роста 37-39 С, оптимум 6,80,2. Характеризуется активным кислотообразованием и накоплением биомассы при культивировании в типовых питательных средах(МРС, тиогликолевой, пептонно-дрожжевой, Бифидум). Не сквашивает стерильное обезжиренное молоко без добавления ростовых факторов. Максимальный титр клеток (6,7109), показатели накопления биомассы (ОП 590 2,1352,197) и активной кислотности ( 3,90,2) регистрируются через 18-24 ч культивирования. Штамм стабилен при хранении при 4 С в питательной среде без нейтрализации в течение 60 суток. Из биомассы штамма выделен ряд липидных компонентов, обладающих иммунологической активностью. Маркерными признаками, отличающими штаммБИМ В-476-Д от исходного штамма 379 и штамма-прототипа-5813, являются резистентность к антибиотикам с различными механизмами действия стабильность при хранении при 4 С в питательной среде без нейтрализации в течение 60 суток биологическая активность липидных компонентов. Стабильность сохранения полезного свойства. Приобретенные признаки сохранялись при поддержании штамма на типовой питательной среде МРС ( 7,0) при длительном(более 6 месяцев) хранении (ежемесячный пересев на питательную среду МРС). Штамм непатогенен, нетоксигенен. Предлагаемый штамм получен впервые и никогда ранее не использовался для получения пробиотических препаратов. Материалы заявки поясняются следующими графическими изображениями фиг. 1 - -хроматограмма липидов, изолированных изБИМ В-476-Д 1 - классический метод, 2-5 - экстракция с помощью 2.- главные гликолипиды,- минорные гликолипиды,- фосфолипиды,- нейтральные липиды фиг. 2 - иммунохимическая реакция междусыворотки здорового кролика и липидными компонентамиБИМ В-476-Д (1 - контроль, 2 - гликолипид,3 - фосфолипид). Технологичность и уникальные биологические свойства заявляемого штамма иллюстрируют следующие примеры. Пример 1. КультивированиеБИМ В-476-Д. Штамм культивируют глубинно на жидкой типовой питательной среде МРС с цистеином указанного выше состава ( 7,0) в течение 18-24 ч при температуре 37 С в микроаэрофильных условиях. Полученная культуральная жидкость является жидкой формой пробиотического препарата. Оптимум температуры 37 С, но штамм растет в интервале температур от 28 до 43 С. Характерно наличие роста приот 5,0 до 7,8. Пример 2. АнтибиотикорезистентностьБИМ В-476-Д. 18510 1 2014.08.30 Антибиотикорезистентность исходного штаммаопределяли по уровню накопления биомассы при культивировании на среде МРС (табл. 1). Далее производили постепенное увеличение концентрации антибиотиков в среде культивирования. В случае отсутствия или частичного ингибирования проводили постепенное увеличение концентрации препарата в среде культивирования от 2,5 до 10 мкг/мл. В случае полного ингибирования осуществляли ряд последовательных пересевов культуры (до 10) в среду с концентрацией препарата 2,5 мкг/мл с целью адаптации штамма к минимальной концентрации антибиотика, а затем начинали увеличивать концентрацию до 10 мкг/мл. Пассажи каждый раз проводились на одном антибиотике, таким образом, последовательно был получен ряд спонтанных мутантов с признаками антибиотикорезистентности. Далее штамм в течение длительного периода (6 месяцев) ежедневно пересевали в среды с максимальными концентрациями препаратов для закрепления признака антибиотикорезистентности. Характер роста бактерий в присутствии антибиотика может быть определен как ингибирование, частичное или полное подавление процесса пролиферации клеток препаратом. Таблица 1 Резистентность исходного штаммак различным антимикробным агентам Резистентность Антибиотик Концентрация, мкг/мл 24 ч 48 ч 2,5 Примечание. - - полное ингибирование роста культуры,- частичное ингибирование,- отсутствие ингибирования. Очевидно, что исходный штамм наиболее чувствителен к кларитромицину и ципрофлоксацину, только при добавлении этих препаратов в минимальной дозе в среду культивирования наблюдалось полное ингибирование роста микроорганизмов. Наименьшая чувствительность была выявлена к азитромицину и метронидазолу. Тримоксазол и 4 18510 1 2014.08.30 амоксициллин оказывали частичное ингибирующее действие на рост бактериальной культуры. По мере увеличения концентрации препаратов чувствительность к ним уменьшалась, однако при увеличении концентрации до 10 мкг/мл снова наблюдалось частичное ингибирование роста через 24 ч культивирования. После многократных последовательных пересевов наблюдалось отсутствие ингибирования через 20-24 ч культивирования, что говорит о полной адаптации бактерий к максимальной концентрации препаратов. В сравнении с прототипом штаммБИМ В-476-Д обладает более выраженной резистентностью к ряду антибиотиков современного поколения. Таблица 2 Минимальная ингибирующая концентрация антибиотиков для штаммовВ-5813 (прототип) иБИМ В-476-ДАнтибиотик В-5813 (прототип) БИМ В-476-Д Эритромицин 0,05 5,0 Олеандомицин 0,1 5,0 Бензилпенициллин 0,4 5,0 Ампициллин 2,0 5,0 Карбенициллин 2,0 7,0 Линкомицин 2,0 не изучено Оксациллин 3,0 5,0 Тетрациклин 3,0 7,0 Гентомицин 10,0 не изучено Метициллин 10,0 7,0 Стрептомицин 24,0 30,0 Левомицетин 65,0 не изучено Леворин 2060,0 не изучено Нистатин 2060,0 3000,0 Кларитромицин 0,05 10,0 Азитромицин не изучено 10,0 Тримоксазол 0,75 10,0 Ципрофлоксацин не изучено 10,0 Метронидазол 0,75 10,0 Амоксициллин 0,5 10,0 По приведенным данным можно сделать вывод, что штаммБИМ В-476-Д обладает свойством резистентности к широкому ряду антибиотиков, используемых в современной терапии инфекционных заболеваний. Пример 3. Полярные липидыБИМ В-476-Д. В настоящее время актуальным является получение штаммов микроорганизмов, которые не только сами являются носителями пробиотических свойств, но и являются продуцентами биологически активных субстанций. Для выделения липидных компонентовБИМ В-476-Д культивирование бактерий проводили в среде МРС в течение 24 ч при 37 С. Полученную биомассу трижды отмывали фосфатным буфером, после чего лиофилизировали. Экстракцию липидов проводили двумя методами с помощью органических растворителей, а также с использованием сверхкритического диоксида углерода (2) 13. При экстракции органическими растворителями к 1 г сухой биомассы добавляли 200 мл смеси 5 18510 1 2014.08.30 растворителей хлороформ-метанол (21) и инкубировали при постоянном перемешивании в течение 24 ч при 37 С. Далее биомассу отделяли от растворителей центрифугированием и экстрагировали заново свежей порцией растворителей при тех же условиях. Экстракты объединяли и упаривали на роторном испарителе. При экстракции липидов из сухой биомассы классическим методом с помощью органических растворителей было получено 21,32 мг экстракта, содержащего нейтральные,фосфо- и гликолипиды. Данный материал в дальнейшем использовался в качестве стандарта гликолипидов. При экстракции гликолипидов из сухой биомассы с использованием сверхкритического диоксида углерода было получено 41,64 мг экстракта. При анализе гликолипидов методом тонкослойной хроматографии было показано, что в клеткахБИМ В-476-Д содержатся полярные липиды (две фракции гликолипидов и фосфолипиды), а также нейтральные липиды (фиг. 1). Выявленные липиды имели одинаковую хроматографическую подвижность как при экстрагировании органическими растворителями, так и при использовании метода сверхкритической флюидной экстракции. Пример 4. Иммунореактивность полярных липидовБИМ В-476-Д. В лунках планшета иммобилизовали липидные компоненты (1 - гликолипид, 2 фосфолипид) следующим образом компоненты добавляли из расчета 0,1 мл на лунку и оставляли при 4 С на ночь. После блокирования антигенов 0,3 раствором куриного сывороточного альбумина в натрий-фосфатном буфере в течение ночи при комнатной температуре промывали буфером (100 мкл/лунка). После каждой стадии анализа лунки также промывали трижды по 0,1 мл буфером. Для определения иммунохимических свойств липидов в лунки планшетов вносили по 0,05 мл разведенных образцов сыворотки здоровых кроликов и инкубировали в течение 3 ч при 4 С. Для анализа использовали растворы сывороток с 100, 200, 400, 800, 1600-кратным разведением, приготовленные на основе натрий-фосфатного буфера ( 7,4). Для выявления , связавшихся с иммобилизованными антигенами, использовали конъюгат пероксидазы из корней хрена (ПХ) с белком(США). Раствор конъюгата (титр 1/20000) инкубировали в лунках планшета в объеме 0,05 мл в течение 1 ч при 24 С. Для инициации ферментативной реакции в лунки вносили по 0,05 мл хромогена (0,01 М тетраметилбензидин в 70 диметилсульфоксиде,разведенный 0,15 М цитрат фосфатным буфером,5,0, содержащим 5 мМ перекись водорода, в соотношении 14), перемешивали содержимое лунок пятью-шестью круговыми движениями планшета по горизонтальной поверхности и выдерживали в течение 10-20 мин при комнатной температуре. Останавливали реакцию добавлением 0,1 мл 4,8 серной кислоты с той же скоростью и в той же последовательности, что и хромогенсубстратную смесь, перемешивали содержимое лунок пятью-шестью круговыми движениями планшета по горизонтальной поверхности 13. Измеряли оптическую плотность при длине волны 450 нм (450) в многоканальном иммуноферментном анализаторе Униплан (Россия). Показано, что гликолипидный компонент обладает иммунореактивностью высокого уровня (выраженная реакция антиген-антитело начинается с 1600-кратного разведения сыворотки), фосфолипидный компонент - иммунореактивностью среднего уровня(800-кратное разведение сыворотки) (фиг. 2). Следовательно, липидные компонентыБИМ В-476-Д достаточно иммунореактивны, чтобы служить специфическими маркерами и быть использованными в целях серологической диагностики. Пример 5. Сохранение жизнеспособностиБИМ В-476-Д после лиофилизации и низкотемпературной консервации. 18510 1 2014.08.30 Лиофилизации подвергают физиологически активную культуруБИМ В-476-Д 3-й генерации. Штамм выращивают по примеру 1 в питательной среде МРС при 37 С в течение 20 ч. Клетки осаждают центрифугированием (10000 об/мин,20 мин), отмывают от культуральной жидкости и ресуспедируют в криозащитной среде(2/3 от исходного объема суспензии). В качестве защитной среды используют стерильное обезжиренное молоко (10 сухих веществ). Полученную суспензию асептически разливают по 0,2 мл в стерильные ампулы для лиофилизации при следующем режиме 1. Стадия лиофильного высушивания (5 ч) при температуре рефрижератора -55 С,глубина вакуума 8-10-2 . 2. Стадия удаления остаточной влаги (2,5 ч) при комнатной температуре, глубина вакуума 8-10-2 . 3. Отпайка ампул под вакуумом. Количество жизнеспособных клеток после лиофилизации определяют методом предельных разведений с последующим высевом в полужидкую тиогликолевую среду. ТитрБИМ В-476-Д составляет 9,1108 КОЕ/мл. Ампулы с лиофильновысушенной биомассой хранят при 4 С. Лиофильно высушенная биомасса является сухой формой пробиотического препарата. Низкотемпературной консервации подвергают физиологически активную культуруБИМ В-476-Д 3-й генерации. Штамм выращивают по примеру 1 в питательной среде МРС при 37 С в течение 20 ч (до достижения ранней стационарной стадии роста). Клетки осаждают центрифугированием (10000 об/мин, 10 мин), отмывают от ростовой среды и ресуспедируют в криозащитной среде (2/3 от исходного объема суспензии). В качестве криозащитной среды используют стерильную питательную среду МРС. Полученную суспензию асептически разливают по 1 мл в стерильные криопробирки и замораживают при -70 С. Титр клеток после низкотемпературной криоконсервации составляет 5,4109 КОЕ/мл. Таким образом, получен уникальный штамм, обладающий по сравнению с известными аналогами более высокой антибиотикорезистентностью, стабильностью при хранении, а также рядом полезных свойств и, как следствие, возможностью применения для получения пробиотического препарата. Получение нового доступного штамма обеспечивает расширение ассортимента штаммов для получения пробиотических препаратов. Источники информации 1. Шендеров Б.А. Медицинская микробная экология и функциональное питание. Т.Пробиотики и функциональное питание. - М. ГРАНТЪ, 2001. - 288 с. 2..,.// . .. - 2004. - . 97. - . 147-156. 3.,,,, ,,//. 2008. - . 20. - . 113-115. 4. Соколов А.А., Митрохин С.Д., Минаев В.И., Забазный Н.П., Сергеев С.А., Широкорад В.И., Сергеев В.П., Амерханова А.М., Афанасьев С.С., Алешкин В.А. Современные подходы к антибиотикопрофилактике госпитальных инфекций у больных, находящихся в отделениях хирургического профиля онкологического стационара // Методические указания. -24. - М., 2007. - 26 С. 5..,..//. - 2003. - . 82. - . 1-11. 18510 1 2014.08.30 6. Корниенко Е.А. Современные принципы выбора пробиотиков // Детские инфекции. - 2007. -3. - С. 64-69. 7..,.,.,.-114001// . . . - 2010. - . 103(1). . 58-68. 8. Гардинер Г.Е., Хайнэман К., Баройя М.Ж., Брюс Э.В., Боэрман Д., Мадренас Д.,Рейд Г. Пероральное введение комбинации пробиотиков-1 и-14 с целью использования их свойств в кишечнике человека. 9. Шустер , Мартьянов В.А., Ивашкина Н.Ю., Пиявский С.А., Медников Б.Л. Возможности оптимизации применения пробиотиков в клинической практике на примере отечественного препарата Аципол // Человек и лекарство. - 2009. -4. - Т. 17. -4. 250 с. 10. Андреева И.В. Доказательное обоснование применения пробиотиков для лечения и профилактики заболеваний ЖКТ // Медицинский совет. - 2007. -3. - С. 25-32. 11. Патент РФ 2048517, 1995. 12.,.,// .. . - 1960. - . 23. - . 130-135. 13. Цыганова А.В., Киселева Е.П., Вашкевич И.П., Прядко А.Г. Характеристика иммуноаффинной хроматографии и новый метод получения тиропероксидазы человека из субклеточных фракций щитовидной железы // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. - Т. 42. -2. - С. 236-246. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8

МПК / Метки

МПК: C12N 1/20

Метки: longum, штамм, bifidobacterium, бифидобактерий, пробиотического, получения, препарата

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/8-18510-shtamm-bifidobakterijj-bifidobacterium-longum-dlya-polucheniya-probioticheskogo-preparata.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Штамм бифидобактерий Bifidobacterium longum для получения пробиотического препарата</a>

Похожие патенты