Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОНЪЮГАТ 28-ГОМОКАСТАСТЕРОНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОГЕНА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Хрипач Владимир Александрович Литвиновская Раиса Павловна Райман Михаил Эдуардович Драч Светлана Васильевна Жабинский Владимир Николаевич Свиридов Олег Васильевич Прядко Андрей Георгиевич Новик Татьяна Валентиновна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Конъюгат 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы ,11832 1 2009.04.30 где БСА - бычий сывороточный альбумин,который может быть использован в качестве белка-носителя для получения антител, специфичных к 28-гомобрассиностероидам. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений 1, 2. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях менее 10-5 . В очень малых концентрациях они проявляют свое биологическое действие. Установлено, например, что при обработке различных сельскохозяйственных культур в дозах 5-20 мг на гектар посевов наблюдается заметный ростстимулирующий и адаптогенный эффект, приводящий к увеличению урожая, повышению качества продукции и устойчивости растений к неблагоприятным условиям и болезням 3-8. Эти свойства брассиностероидов делают их привлекательными в качестве основы для агропрепаратов. Одним из наиболее активных брассиностероидов является 28-гомобрассинолид, на основе которого разработан препарат ЭПИН-плюс 9. В связи с этим актуальной является разработка методов анализа 28-гомобрассинолида, а также его химического и биохимического предшественника 28-гомокастастерона (далее 28-гомобрассиностероиды). В качестве такого метода нами предложен метод иммуноферментного определения 28 гомобрассиностероидов, который, прежде всего, требует наличия соответствующего иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками, которые (конъюгаты), в свою очередь, могут быть получены через соответствующие гаптены. Известен конъюгат брассинолида с БСА формулы в котором связь брассиностероида с белком осуществляется через 3-гидроксигруппу 10. К недостаткам данного конъюгата следует отнести, прежде всего связывание (маскировку) 3-гидроксигруппы, которая относится к группам, ответственным за биологическую активность брассиностероидов, что может сказаться отрицательно на специфичности вырабатываемых животными антител. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает этот конъюгат нестабильным 11. 2 11832 1 2009.04.30 Наиболее близкими к заявляемому является конъюгаты с БСА кастастерона формулы Гаптенпредложен авторами для радиоиммуноанализа брассиностероидов 12. Конъюгат получен на основе 24-метилбрассиностероида - кастастерона, однако он не позволил получить антитела, специфичные даже к этой группе брассиностероидов - показатели перекрестных реакций с изученными авторами брассиностероидами составляли от 20 до 50 . На основе гаптенасинтезирован конъюгат с БСА, который был использован авторами 13, 14 для получения антител, специфичных к 24-метилбрассиностероидам. Целью изобретения является конъюгат 28-гомокастастерона и бычьего сывороточного альбумина, позволяющий получить высокоспецифичные антитела к 28-гомобрассиностероидам. Поставленная цель достигается заявляемым соединением , которое получают взаимодействием -оксисукцинимидного эфира (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси 24-этил-5-холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты (гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в водно-диоксановом растворе, очисткой образовавшегося конъюгата путем диализа и лиофилизацией конъюгата. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1. Растворяют 0,031 г (0,056 ммоль) оксима (1) и 0,008 г (0,07 ммоль) -оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана. Охлаждают до 5 С и при перемешивании добавляют раствор 0,012 мг дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 С и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Осадок растворяют в этилацетате, дополнительно образовавшийся осадок дициклогексилкарбомочевины отфильтровывают, фильтрат упаривают. Получают 0,035 мг (94 ) 6-оксисукцинимидного эфира (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-этил-5 холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты. Маслообразное вещество. ИК спектр(1 Н, С 3-Н), 4,52 м (2 Н, -О-СН 2-СООН). К раствору 52 мг (0,75 мкмоль) БСА в смеси 9 мл воды и 1 мл насыщенного раствора 3 (8,3) добавляют раствор 35 мг (55 мкмоль) 6-оксисукцинимидного эфира(22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-этил-5-холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты в 10 мл диоксана. Раствор перемешивают 20 ч при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергают диализу при 20 С против дистиллированной воды в течение 36 ч, затем 20 ч - против 1 -ной суспензии активированного угля в воде, лиофилизуют и замораживают при температуре -20 С. Содержание гаптена в конъюгате,определенное спектрофотометрически, составляет 23 моль гаптена на 1 моль белка. 3 11832 1 2009.04.30 Полученный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 28 гомобрассиностероидам (28-гомобрассинолид и 28-гомокастастерон), что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 2. Группу из шести кроликов иммунизируют конъюгатом 28-гомокастастерон-БСА с плотностью посадки 23 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного 0,1 М раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляют 2 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие связывающей способности в отношении кастастерона и определяют их титры и значения констант ассоциации (Ка). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки,обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,5-0,2 ОЕ. Таблица 1 Характеристики антисыворотки, полученной при иммунизации животных конъюгатом 28-гомокастастерона с БСА. Антисыворотка Титр Ка 109 М-1 1 4,5 50000 Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало,что ее разбавление в 50 000 (1) раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения как 28-гомокастастерона, так и 28-гомобрассинолида, проявивших, как и ожидалось,сравнимые параметры связывания с антителами. Специфичность. Перекрестная реакция антител, полученных к 28-гомокастастерону, с другими брассиностероидами и стероидами различных классов приведена в табл. 2. Таблица 2 Кросс-реактивность антисыворотки 1 с различными стероидами Кросс-реактивность антисыворотки к 28-гомокастастерону со стероидами различного строения Связывание по отношению к 28 Структурная формула Название п/п гомокастастерону,Продолжение таблицы 2 Связывание по отношению к 28 гомокастастерону,Продолжение таблицы 2 Связывание по отношению к 28 гомокастастерону,Продолжение таблицы 2 Связывание по отношению к 28 гомокастастерону,Заявляемый конъюгат получается с высоким выходом, обладает стабильностью, высокой степенью посадки гаптена на белок, обеспечивает необходимую иммуногенность и позволяет получать антитела, специфичные к 28-гомобрассинолиду и 28-гомокастастерону. Источники информации 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Мн. Навукатэхнка, 1993. - 288 с. 2.,,.11832 1 2009.04.30 8. Патент РБ 5698, 2003. 9. ТУ РБ 100185129.048 - 2002. Брассиностероиды и препаративные композиции на их основе. - Введ. 2003-02-05. Каталог Технические условия. - Мн. Из-во Госстандарт РБ,2007. Т.2. - С. 549. 10.,//. (.). - 1988. - . 86. . 113. 11.,2 -// . . . - 1985. - .81. - . 245. 12.Т.,.,.,.,.//. - 1990. - . 9. - .151. 13. Хрипач В.А., Свиридов О.В., Прядко А.Г., Литвиновская Р.П., Драч С.В., Матвеенцев В.Д., Новик Т.В., Михайлопуло К.И., Жабинский В.Н., Завадская М.И., Аверькова М.А., Драченова О.А., Чащина Н.М. Иммуноферментный анализ (24)-брассиностероидов // Биоорганическая химия. - 2007. - Т.33. -3. - С. 371-378. 14. Патент РБ 9770, МПК С 07 41/00, 2007. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 8

МПК / Метки

МПК: C07J 41/00

Метки: конъюгат, качестве, бычьим, альбумином, 28-гомокастастерона, сывороточным, иммуногена

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/8-11832-konyugat-28-gomokastasterona-s-bychim-syvorotochnym-albuminom-v-kachestve-immunogena.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Конъюгат 28-гомокастастерона с бычьим сывороточным альбумином в качестве иммуногена</a>

Похожие патенты