Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ СОРТОВОЙ ГОЛУБИКИ ВЫСОКОЙ. В КУЛЬТУРУ(71) Заявители Учреждение образования Полесский государственный университет Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Кудряшова Оксана Александровна Волотович Антон Анатольевич Герасимович Татьяна Васильевна Гук Екатерина Сергеевна Глеб Елена Павловна Хрипач Владимир Александрович(73) Патентообладатели Учреждение образования Полесский государственный университет Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Способ введения сортовой голубики высокой. в культуру, заключающийся в том, что подготавливают первичный эксплант, представляющий собой неодревесневший верхушечный фрагмент стебля длиной 15 мм с почками, промывают его хозяйственным мылом в проточной воде, выдерживают в течение 20 мин в водном растворе, содержащем 2 г/л фунгицида ридомил голд, 2 г/л фунгицида брайтануниверсал, 20 мл/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л 20, промывают стерильной дистиллированной водой, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты, стерилизуют в течение 25 мин в растворе, содержащем 7,5 гипохлорита натрия, 20 мл/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л 20, промывают стерильной дистиллированной водой, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты, высаживают первичный эксплант на питательную среду с 4,8-5,0, содержащую следующие компоненты, мг на 1 л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислая пятиводная 0,25 борная кислота 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 18431 1 2014.08.30 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновая кислота 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 15,00 6-(,-диметилаллиламино)пурин индолилуксусная кислота 4,00 24-эпибрассинолид 0,50-0,75 сахароза 30 000,00 агар-агар 8 000,00 вода деионизированная остальное,инкубируют в течение 8 недель при освещении 6000 лк, фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь,температуре 25 С и относительной влажности воздуха 70 , затем черенкуют и высаживают на питательную среду. Изобретение относится к сфере биотехнологии, к области клеточных технологий в растениеводстве, к направлению клонального микроразмножения растений. Области применения изобретения биотехнология, сельское и лесное хозяйство, пищевая и медицинская промышленность. Известно, что процесс клонального микроразмножения растенийначинается с этапа введения растений в культурупутем изолирования и стерилизации первичного экспланта с последующим его размещением на стерильной, питательной среде для инициации побегообразования 1,2. Согласно прототипу 2 первичные экспланты сортовой голубики высокой. в виде фрагментов стебля длиной 15 мм с почками промывают 2-3 ч в проточной воде, затем 20-30 мин - в дистиллированной воде и стерилизуют в 0,1 -ном растворе диацида в течение 11-18 мин с последующей трехкратной отмывкой первичных эксплантов в дистиллированной воде и высадкой на питательную агаризованную среду,содержащую аммоний азотнокислый, калий сернокислый, магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций азотнокислый, кальция хлорид, марганец сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислую, борную кислоту, натрий молибденовокислый, железосернокислое, трилон Б, тиамина хлорид, пиридоксина хлорид, никотиновую кислоту, глицин, мезо-инозитол, аденина сульфат, 6-(,-диметилаллиламино)пурин, индолилуксусную кислоту. Недостатками данного способа введения сортовой голубики высокой в культуруявляются крайне низкий выход жизнеспособных, стерильных первичных эксплантов, способных активно регенерироватьс образованием побегов, пригодных для дальнейшего размножениявысокий расход дорогостоящих компонентов питательной агаризованной среды вследствие низкого выхода активно регенерирующихстерильных первичных эксплантов, что приводит к удорожанию размножаемогопосадочного материала сортовой голубики высокой трудоемкость метода из-за необоснованной, чрезмерной временной протяженности отдельных операций. 18431 1 2014.08.30 Задача изобретения заключается в модификации способа асептического введения сортовой голубики высокой в культурус целью сокращения продолжительности работ и существенного повышения выхода активно регенерирующихстерильных первичных эксплантов сортовой голубики высокой. Задача решается тем, что последовательно выполняются следующие действия во-первых, вместо операций по подготовке первичных эксплантов в виде фрагментов стебля с почками к стерилизации, включающих промывание первичных эксплантов на протяжении 2-3 ч в проточной воде и затем 20-30 мин в дистиллированной воде, предлагается после предварительного отмывания первичных эксплантов мылом хозяйственным(72 ) в проточной воде выдерживать первичные экспланты, представляющие собой неодревесневший верхушечный фрагмент стебля длиной 15 мм с почками, на протяжении 20 мин в водном растворе, содержащем 2 г/л фунгицида ридомил голд, 2 г/л фунгицида байтан-универсал, 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л 20, с последующим трехкратным отмыванием первичных эксплантов в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты во-вторых, вместо стерилизации первичных эксплантов в 0,1 -ном растворе диацида в течение 11-18 мин, предлагается стерилизацию первичных эксплантов осуществлять в 7,5 -ном растворе гипохлорита натрия в присутствии 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л 20 на протяжении 25 мин, с последующим трехкратным отмыванием первичных эксплантов в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты в-третьих, после стерилизации и отмывки осуществляется высадка первичных эксплантов на питательную среду, содержащую аммоний азотнокислый, калий сернокислый,магний сернокислый, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций азотнокислый,кальция хлорид, марганец сернокислый, цинк сернокислый, медь сернокислую, борную кислоту, натрий молибденовокислый, железосернокислое, трилон Б, тиамина хлорид,пиридоксина хлорид, никотиновую кислоту, глицин, мезо-инозитол, аденин сульфат,6-(,-диметилаллиламино)пурин, индолилуксусную кислоту, сахарозу, агар-агар, дополненную 24-эпибрассинолидом, при следующем соотношении компонентов в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислая пятиводная 0,25 борная кислота 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновая кислота 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 15,00 6-(,-диметилаллиламино)пурин индолилуксусная кислота 4,00 24-эпибрассинолид 0,50-0,75 3 18431 1 2014.08.30 сахароза 30000,00 агар-агар 8000,00 вода деионизированная остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Модифицированная нами питательная среда при соблюдении остальных представленных выше модификаций способа введения сортовой голубики высокой. в культурупозволяет увеличить выход активно регенерирующих стерильных эксплантов на 3,8-65,0 в зависимости от генотипа (сорта). Пример 1. Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО Полесский государственный университет. В качестве первичных эксплантов сортов Патриот, Нортланд, Эрлиблю, Джерси,Блюкроп голубики высокой. используют неодревесневшие верхушечные фрагменты стебля длиной 15 мм с почками. Первичные экспланты отмывают мылом хозяйственным (72 ) в проточной воде, выдерживают на протяжении 20 мин в водном растворе, содержащем 2 г/л фунгицида ридомил голд, 2 г/л фунгицида байтануниверсал, 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л 20, отмывают трижды в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты, стерилизуют в 7,5 -ном растворе гипохлорита натрия в присутствии 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л 20 на протяжении 25 мин, отмывают трижды в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты, и высаживают на модифицированную нами питательную среду, содержащую в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислая пятиводная 0,25 борная кислота 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновая кислота 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 15,00 6-(,-диметилаллиламино)пурин индолилуксусная кислота 4,00 24-эпибрассинолид 0,50 сахароза 30000,00 агар-агар 8000,00 вода деионизированная остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Пробирки диаметром 22 мм с высаженными первичными эксплантами инкубируют при температуре 25 С, фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь, освещении 6000 лк, относительной влажности воздуха 70 . 4 18431 1 2014.08.30 Учет общего количества стерильных первичных эксплантов и количества активно регенерирующих стерильных первичных эксплантов проводят еженедельно на протяжении 8 недель, после чего регенерировавшие побеги черенкуют и высаживают в колбы на стандартную питательную среду иного состава для размножения регенерантов. Результаты исследований сведены в табл. 1-6. Таблица 1 Выход стерильных эксплантовсорта Патриот голубики высокой через 8 недель после стерилизации, эксперимент 1 Количество Количество активно Общее количестерильных регенерирующих стеВариант опыта ство первичных первичных экс- рильных первичных эксплантов, шт плантов,эксплантов,1 (контроль) 111 74,0 9,0 2 (0,50 мг/л эпибрассинолида) 70 92,9 25,7 Примечание 1 - контрольная питательная среда для инициации побегообразования 2 - модифицированная питательная среда для инициации побегообразования,содержащая дополнительно 0,50 мг/л 24-эпибрассинолида. То же для табл. 2-6. Таблица 2 Выход стерильных эксплантовсорта Патриот голубики высокой через 8 недель после стерилизации, эксперимент 2 Общее колиКоличество сте- Количество активно чество перрильных первич- регенерирующих стеВариант опыта вичных ных рильных первичных эксплантов,эксплантов,эксплантов,шт 1 (контроль) 50 42,0 18,0 2 (0,50 мг/л эпибрассинолида) 62 56,5 25,8 Таблица 3 Выход стерильных эксплантовсорта Нортланд голубики высокой через 8 недель после стерилизации Количество сте- Количество активно Общее количестрильных пер- регенерирующих стеВариант опыта во первичных вичных рильных первичных эксплантов, шт эксплантов,эксплантов,1 (контроль) 48 68,0 17,0 2 (0,50 мг/л эпибрассинолида) 28 100,0 82,0 Таблица 4 Выход стерильных эксплантовсорта Джерси голубики высокой через 8 недель после стерилизации Вариант опыта Общее количе- Количество сте- Количество активно ство первичных рильных пер- регенерирующих стеэксплантов, шт вичных рильных первичных эксплантов,эксплантов,1 (контроль) 48 87,5 12,5 2 (0,50 мг/л эпибрассинолида) 104 90,4 24,0 18431 1 2014.08.30 Таблица 5 Выход стерильных эксплантовсорта Эрлиблю голубики высокой через 8 недель после стерилизации Количество сте- Количество активно Общее количерильных пер- регенерирующих стеВариант опыта ство первичных вичных рильных первичных эксплантов, шт эксплантов,эксплантов,1 (контроль) 43 88,4 11,6 2 (0,50 мг/л эпибрассинолида) 67 82,1 17,9 Таблица 6 Выход стерильных эксплантовсорта Блюкроп голубики высокой через 8 недель после стерилизации Общее количе- Количество сте- Количество активно ство первичрильных пер- регенерирующих стеВариант опыта ных вичных рильных первичных эксплантов, шт эксплантов,эксплантов,1 (контроль) 88 37,7 22,4 2 (0,50 мг/л эпибрассинолида) 91 64,8 26,2 Пример 2. Исследования проводили на базе биотехнологической лаборатории НИЛ клеточных технологий в растениеводстве УО Полесский государственный университет. В качестве первичных эксплантов сорта Блюкроп голубики высокой. используют неодревесневшие верхушечные фрагменты стебля длиной 15 мм с почками. Первичные экспланты отмывают мылом хозяйственным (72 ) в проточной воде, выдерживают на протяжении 20 мин в водном растворе, содержащем 2 г/л фунгицида ридомил голд, 2 г/л фунгицида байтан-универсал, 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л 20, отмывают трижды в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты, стерилизуют в 7,5 -ном растворе гипохлорита натрия в присутствии 20 мг/л аскорбиновой кислоты и 3 мл/л 20 на протяжении 25 мин, отмывают трижды в стерильной дистиллированной воде, содержащей 20 мг/л аскорбиновой кислоты,и высаживают на модифицированную нами питательную среду, содержащую в мг/л аммоний азотнокислый 400,00 калий сернокислый 990,00 магний сернокислый семиводный 370,00 калий фосфорнокислый однозамещенный 170,00 кальций азотнокислый 400,00 кальция хлорид 82,80 марганец сернокислый одноводный 16,90 цинк сернокислый семиводный 8,60 медь сернокислая пятиводная 0,25 борная кислота 6,20 натрий молибденовокислый двухводный 0,25 железосернокислое семиводное 27,80 трилон Б 37,30 тиамина хлорид 1,00 пиридоксина хлорид 0,50 никотиновая кислота 0,50 глицин 2,00 мезоинозитол 100,00 аденина сульфат 80,00 6 18431 1 2014.08.30 15,00 6-(,-диметилаллиламино)пурин индолилуксусная кислота 4,00 24-эпибрассинолид 0,75 сахароза 30000,00 агар-агар 8000,00 вода деионизированная остальное. Кислотность питательной среды 4,8-5,0. Пробирки диаметром 22 мм с высаженными первичными эксплантами инкубируют при температуре 25 С, фотопериоде 16 ч день, 8 ч ночь, освещении 6000 лк, относительной влажности воздуха 70 . Учет общего количества стерильных первичных эксплантов и количества активно регенерирующих стерильных первичных эксплантов проводят еженедельно на протяжении 8 недель, после чего регенерировавшие побеги черенкуют и высаживают в колбы на стандартную питательную среду иного состава для размножения регенерантов. Результаты исследований сведены в табл. 7. Таблица 7 Выход стерильных эксплантовсорта Блюкроп голубики высокой через 8 недель после стерилизации Количество сте- Количество активно Общее количерильных перрегенерирующих стеВариант опыта ство первичных вичных рильных первичных эксплантов, шт эксплантов,эксплантов,1 (контроль) 57 33,4 15,8 2 (0,75 мг/л эпибрассинолида) 58 46,6 34,5 Примечание 1 - контрольная питательная среда для инициации побегообразования 2 - модифицированная питательная среда для инициации побегообразования,содержащая дополнительно 0,75 мг/л 24-эпибрассинолида. Источники информации 1. Решетников В.Н. и др. Некоторые аспекты микроклонального размножения голубики высокой и брусники обыкновенной // Плодоводство. - 2007. - Т. 19. - С. 209-216. 2. Сидорович Е.А., Кутас Е.Н. Клональное микроразмножение новых плодово- ягодных растений. - Минск, 1996. - С. 63 (прототип). Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7

МПК / Метки

МПК: A01H 4/00

Метки: corymbosum, культуру, высокой, vitro, голубики, способ, vaccinium, введения, сортовой

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/7-18431-sposob-vvedeniya-sortovojj-golubiki-vysokojj-vaccinium-corymbosum-l-v-kulturu-in-vitro.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ введения сортовой голубики высокой Vaccinium corymbosum L. в культуру in vitro</a>

Похожие патенты