Способ оценки активности воспалительного процесса с контролем течения бронхиальной астмы

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ АКТИВНОСТИ ВОСПАЛИТЕЛЬНОГО ПРОЦЕССА С КОНТРОЛЕМ ТЕЧЕНИЯ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМЫ(71) Заявитель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет(72) Авторы Антонович Жанна Владимировна Царев Владимир Петрович Гончарова Наталья Васильевна(73) Патентообладатель Учреждение образования Белорусский государственный медицинский университет(57) Способ оценки активности воспалительного процесса с контролем течения бронхиальной астмы, отличающийся тем, что в периферической крови пациента методом проточной цитофлюориметрии определяют количество естественных регуляторных -клеток 425 и активированных клеток 25, сравнивают с количеством соответствующих клеток у здорового человека и при снижении у пациента количества 425 более чем в три раза и повышении 25 более чем в полтора раза активность воспалительного процесса оценивают как высокую при обострении бронхиальной астмы, при снижении количества 425 примерно на 25 и увеличении 25 примерно на 7 активность воспалительного процесса оценивают как умеренную при неконтролируемом течении бронхиальной астмы, а при количестве 425 и 25, равном или сниженном примерно на 11 , активность воспалительного процесса оценивают как низкую при контролируемом течении бронхиальной астмы. Изобретение относится медицине, а именно к пульмонологии, аллергологии и лабораторной диагностике, и может быть использовано для оценки контроля над течением бронхиальной астмы, определения эффективности противовоспалительной терапии и для прогноза. Бронхиальная астма (БА) - это хроническое воспалительное заболевание дыхательных путей, в котором принимают участие многие клетки и клеточные элементы. Хроническое воспаление обусловливает развитие бронхиальной гиперреактивности, которая приводит к повторяющимся эпизодам свистящих хрипов, одышки, чувства заложенности в груди и кашля, особенно по ночам или ранним утром. Эти эпизоды обычно связаны с распространенной, но изменяющейся по своей выраженности обструкцией дыхательных путей в легких, которая часто бывает обратимой либо спонтанно, либо под действием лечения 1. Хотя симптомы БА возникают эпизодически, воспаление дыхательных путей имеет хро 14554 1 2011.06.30 нический характер и достигает наибольшей активности в период обострения БА, интенсивность воспаления снижается по мере достижения контроля над БА. Задачей врача является определение у каждого отдельного пациента степени активности воспаления, уровня контроля над БА и назначение объема терапии, направленного на достижение и поддержание контроля над БА. Данные о способности естественных регуляторных -клеток (425-клетки) подавлять аллергические процессы получены в контролируемых условиях экспериментови 2. Отмечена способность естественных регуляторных -клеток подавлять активность как -лимфоцитов-хелперов 1-го типа (1), так и -лимфоцитовхелперов 2-го типа (2) 3, однако, очевидно, сильнее проявляется их действие на те субпопуляции -хелперов, функция которых повышена, что обозначается как регулирующее действие 425-клеток на баланс 1/2-клеток 4. Так, при БА преимущественно проявляется подавляющее действие 425-клеток на 2-ответ, вызванный аллергенами и определяющий активность аллергического воспалительного процесса 5. Снижение количества естественных регуляторных -клеток при БА, наиболее выраженное в период обострения заболевания, может объяснять повышение активности 2-клеток,характерное для БА. 25-клетки представляют собой активированные - и-лимфоциты, активированные макрофаги, принимающие участие в патогенезе БА и отражающие активность воспалительного процесса. Известен способ оценки активности воспаления при бронхиальной астме (аналог) 6. Сущность изобретения состоит в том, что проводят реакцию кожного окна, мазки, полученные через 12 и 24 часа, фиксируют метанолом и окрашивают по Нохту, определяют число нейтрофилов и макрофагов, подсчитывая от 100 до 500 клеток в каждом мазке, и при процентном содержании нейтрофилов 57,784,40 через 12 часов и 32,353,61 через 24 часа определяют первую степень активности воспалительного процесса, а при процентном содержании нейтрофилов 62,565,50 через 12 часов и 40,886,22 через 24 часа определяют вторую степень активности воспаления. Недостаток способа заключается в том, что для его осуществления требуется соскабливание эпидермиса на ладонной поверхности предплечий в 4-х местах и прикрепление к каждому скарифицированному участку кожи пластырем предметного стекла на 3, 6, 12,24 часа, что сопряжено с дискомфортом для пациента, а также с недостаточной безопасностью и точностью метода. Кроме этого, задачей данного способа являлось определение активности воспаления только в период обострения БА. Наиболее близким к заявляемому является способ оценки активности и характера воспаления дыхательных путей 7. Сущность способа заключается в том, что у больного получают бронхоальвеолярный лаваж, в котором определяют биологические маркеры воспаления. В качестве такого маркера используют метаболиты оксида азота при увеличении их концентрации в период обострения более чем в два раза по сравнению с контролем судят об активности воспаления, а показатели ниже контрольных в два раза и более в период ремиссии указывают на необратимый характер воспаления дыхательных путей. Недостаток способа заключается в том, что он трудоемок для исследователя, требует проведения анестезии, инвазивен и, следовательно, опасен ятрогенными осложнениями для пациента и потому не показан в период обострения БА. Этот способ не может быть выбран в качестве прототипа, так как не имеет общих признаков с заявляемым. Задача изобретения заключается в повышении безопасности способа при сохранении высокой информативности, получении возможности объективной оценки уровня контроля над бронхиальной астмой, мониторирования течения бронхиальной астмы и оптимизации лечебных программ. Поставленная задача решается за счет того, что в периферической крови пациента методом проточной цитофлюориметрии определяют количество естественных регуляторных 2-клеток 425 и активированных клеток 25, сравнивают с количеством соответствующих клеток у здорового человека и при снижении у пациента количества 425 более чем в три раз, и повышении 25 более чем в полтора раза активность воспалительного процесса оценивают как высокую при обострении бронхиальной астмы, при снижении количества 425 примерно на 25 и увеличении 25 примерно на 7 активность воспалительного процесса оценивают как умеренную при неконтролируемом течении бронхиальной астмы, а при количестве 425 и 25, равном или сниженном примерно на 11 , активность воспалительного процесса оценивают как низкую при контролируемом течении бронхиальной астмы. Сущность изобретения состоит в том, что у больного утром натощак производят забор крови из локтевой вены в объеме 2-4 мл в пробирки с гепарином (20 ЕД на 1 мл крови) и доставляют в иммунологическую лабораторию. В работе используют стандартное оборудование для иммунологической лаборатории. Определяют количество активированных клеток (25) и естественных регуляторных -клеток (425) методом прямой иммунофлюоресценции на проточном цитофлюориметре( ,США). Естественные регуляторные -клетки определяются как фракция 425 лимфоцитов с высоким уровнем экспрессии 25 (425-клетки). К 100 мкл цельной крови добавляют в соответствии с инструкцией фирмы-производителя 20 мкл антиген-специфичных моноклональных антител ( , США) к дифференцировочным клеточным антигенам 25, 4 25, конъюгированных с флюорохромами фикоэритриномили флюоресцеин изотиоцианатом . Содержимое пробирок тщательно ресуспендируют и инкубируют в темноте при комнатной температуре в течение 30 мин. После инкубации производят лизис эритроцитов лизирующим раствором на основе хлорида аммония (в соотношении кровьлизирующий раствор 110) в темноте при комнатной температуре в течение 10 мин. После лизиса образцы дважды отмывают отмывочным буфером, центрифугируют при 1500 об/мин в течение 7-10 мин. Далее удаляют супернатант, избегая перемешивания осадка. В пробирки вносят 200 мкл 2 параформальдегида ( 7,2). Применяют изотипический контроль того же изотипа, что и моноклональные антитела. Учет и анализ данных производят в автоматическом режиме на лазерном проточном цитофлюориметре( , США) с использованием программы . Популяции и субпопуляции лимфоцитов оценивают в гейте лимфоцитов. На пробу анализируется не менее 30 000 клеток. Изобретение поясняется примерами. Пример 1. Больной И., мужчина, 48 лет. Диагноз БА, смешанная форма, среднетяжелое персистирующее течение. Период обострения. ДН . Длительность заболевания 8 лет. Клиническая выраженность симптомов - 44 балла, по данным спирометрии ОФВ 148 . По данным иммунологического исследования количество естественных регуляторных -клеток 1,26(в 5,86 раза ниже, чем у здорового человека (пример 4,количество активированных клеток 18,05 , (в 4,11 раза выше чем, у здорового человека (пример 4. Показатели соответствуют высокой активности воспалительного процесса и обострению БА. Пример 2. Больная Ш., женщина, 52 года. Диагноз БА, смешанная форма, среднетяжелое персистирующее неконтролируемое течение. ДН . Длительность заболевания 12 лет. Клиническая выраженность симптомов - 8 баллов, по данным спирометрии ОФВ 170 . По результатам иммунологического исследования количество естественных регуляторных -клеток 4,60(на 37,8 ниже, чем у здорового человека (пример 4,количество активированных клеток 5,46(на 19,6 выше, чем у здорового человека(пример 4. Показатели соответствуют умеренной активности воспалительного процесса и неконтролируемой БА. 3 14554 1 2011.06.30 Пример 3. Больная И., женщина, 47 лет. Диагноз БА, смешанная форма, легкое персистирующее контролируемое течение. ДН 0. Длительность заболевания 10 лет. Клиническая выраженность симптомов - 1 балл, по данным спирометрии ОФВ 192 . По результатам иммунологического исследования количество естественных регуляторных -клеток 6,89(на 6,64 ниже, чем у здорового человека (пример 4,количество активированных клеток 2,89(ниже, чем у здорового человека (пример 4. Показатели соответствуют низкой степени активности воспаления и контролируемой БА. Пример 4. Здоровая женщина Н., 43 года. По данным спирометрии ОФВ 1126 . По результатам иммунологического исследования количество естественных регуляторных -клеток 7,38 , количество активированных клеток 4,39 . По данным спирометрии ОФВ 1126 . Сравнительная характеристика больных БА и здорового человека представлена в табл. 1. Таблица 1 Сравнительная характеристика больных БА и здорового человека Обследованные лица Параметр и ед. измеЗдоровая женщирения Больной И. Больная Ш. Больная И. на Н. Возраст, годы 48 52 47 43 Естественные регуляторные -клетки,1,26 4,60 6,89 7,38 клеток Активированные 18,05 5,46 2,89 4,39 клетки,клеток Степень активности высокая умеренная низкая воспаления неконтролируе- контролируемая Уровень контроля обострение контроль мая БА БА Выраженность клинических симптомов,44 8 1 баллы ОФВ 148 70 92 126 Оценка степени активности воспаления при БА по уровню естественных регуляторных -клеток и активированных клеток подтверждается результатами клинического и спирометрического исследований (выраженность клинических симптомов, баллы и ОФВ 1,- данные табл. 1). Всего было обследовано 96 пациентов и 30 практически здоровых лиц. Поскольку заявляемый способ рекомендуется использовать для оценки активности воспаления у больных БА с разными уровнями контроля над заболеванием, все пациенты были предварительно обследованы по тому плану, который предусмотрен для данной категории больных. Методы включали сбор анамнеза и количественную оценку выраженности основных клинических проявлений бронхиальной астмы (приступов удушья, кашля,одышки, отхождения мокроты), потребности в ингаляциях 2-агонистов короткого действия, данных аускультации легких исследование показателей функции внешнего дыхания (ЖЕЛ, ФЖЕЛ, ОВФ 1, ОВФ 1/ЖЕЛ, ОВФ 1/ФЖЕЛ, ПОСвыд, 25, 50, 75,2575, МВЛ), выполнение бронходилятационного теста методом спирометрии. Выраженность клинических симптомов БА оценивалась по 4-балльной шкале, когда трем баллам соответствует максимальное проявление признака, а нулю - отсутствие симптома. По результатам клинического и спирометрического исследований все пациенты по уровню контроля над БА разделились на три группы пациенты с обострением БА (48),4 14554 1 2011.06.30 пациенты с неконтролируемым течением БА (21) и пациенты с контролируемым течением БА (полный и частичный контроль) (27). Группу контроля составили 30 практически здоровых лиц. Обострение БА определялось как необычно острая и тяжелая потеря контроля над заболеванием, требующая неотложной терапии, и протекало в виде острого приступа или затяжного варианта (астматического статуса), который мог сохраняться более 24 часов и сопровождался на фоне персистирующей бронхиальной обструкции повторными острыми приступами удушья. Период ремиссии (межприступный период) характеризовался отсутствием острых приступов и персистирующей бронхиальной обструкции. При полной ремиссии показатели функции внешнего дыхания соответствовали возрастной или индивидуальной норме 1. Контролируемым течение БА считалось при полном отсутствии всех проявлений болезни (допускалось лишь наличие отдельных дневных симптомов и потребности в ингаляциях 2-агонистов короткого действия не чаще 2 раз в неделю). При частичном контроле у больных Б А могли возникнуть более частые дневные симптомы, ограничения повседневной активности, более частая потребность в ингаляциях 2-агонистов короткого действия, ночные пробуждения или могли нарушиться показатели спирометрии (объем форсированного выдоха за 1-ю секунду (ОФВ 1) менее 80 от должного), частота обострений - 1 и более в год. При наличии 3 и более показателей частичного контроля в любую неделю и/или 1 обострения в течение любой недели течение БА считалось неконтролируемым 1. Иммунологические показатели были сопоставлены с результатами клинических и функциональных исследований. Сравнение особенностей иммунологических данных в группах больных БА с группой практически здоровых лиц позволило выделить групповые отличия, которые можно использовать как критерии активности воспаления при разных уровнях контроля над БА. Статистическую обработку материала выполняли с использованием пакета прикладных программ 6,0. К количественным признакам, имеющим нормальное распределение (критерий Шапиро-Уилка р 0,05), применялись параметрические методы и использовался -критерий Стьюдента. К количественным признакам, имеющим распределение, отличное от нормального (критерий Шапиро-Уилка р 0,05), а также к качественным (порядковым или номинальным) признакам применялись непараметрические методы и использовался критерий Манна-Уитни. Для сравнения двух групп по полу строились четырехпольные таблицы абсолютных частот и использовался точный критерий Фишера(двусторонний тест). Для анализа взаимосвязи количественного и качественного признаков использовался непараметрический корреляционный метод Спирмена. Значения показателей приводятся в виде среднее значениестандартное отклонение (М) для значений признаков, подчиняющихся нормальному распределению, и медиана(верхний квартиль нижний квартиль) для не подчиняющихся нормальному распределению значений. За критический уровень статистической значимости принимали вероятность безошибочного прогноза, равную 95(0,05) 8. При проведении корреляционного анализа по Спирмену установлено, что между количеством естественных регуляторных -клеток (процент клеток) и степенью активности воспалительного процесса, определяемой по уровню контроля над БА (с учетом клинических и спирометрических данных), существуют сильные обратные корреляционные связи,о чем свидетельствуют данные коэффициента корреляции-0,853 0,00196 отмечены также умеренные положительные корреляционные связи между количеством активированных клеток и степенью активности воспалительного процесса, определяемой по уровню контроля над БА (с учетом клинических и спирометрических данных) (0,347 0,00196). Иначе, снижение количества естественных регуляторных -клеток и повышение количества активированных клеток при бронхиальной астме совпадает с обострением заболевания, утяжелением клинической симптоматики и ухудшением пока 5 14554 1 2011.06.30 зателей бронхиальной проходимости. Сравнительная характеристика групп больных БА в зависимости от активности воспалительного процесса и уровня контроля над заболеванием и группы практически здоровых лиц представлена в табл. 2. Таблица 2 Сравнительная характеристика групп больных БА в зависимости от активности воспалительного процесса и уровня контроля над заболеванием и группы практически здоровых лиц Группы обследованных Больные с контроБольные БА в Больные с неконтро- лируемой БА (пол- Практически фазе обострения лируемой БА ный и частичный здоровые лица контроль) Параметр Примечание. Во всех сравнениях 0,05, кроме- р 0,001 по сравнению с группой больных с неконтролируемой БА и группой больных с контролируемой БА- 0,001 по сравнению с группой больных с контролируемой БА- 0,001 по сравнению с группой больных с контролируемой БА и группой практически здоровых лиц 0,001 по сравнению с группой практически здоровых лиц,0,030 по сравнению с группой больных с неконтролируемой БА и 0,002 по сравнению с группой больных с контролируемой БА-0,023 по сравнению с группой практически здоровых лиц- 0,001 по сравнению с группами практически здоровых лиц и больных с неконтролируемой и контролируемой БА- 0,001 по сравнению с группой практически здоровых лиц,0,005 по сравнению с группой больных с контролируемой БА. 6 14554 1 2011.06.30 Способ позволяет наиболее точно определять степень активности воспалительного процесса при БА, уровень контроля над БА, мониторировать течение болезни, оптимизировать лечебные программы с целью достижения контроля над БА. Кроме этого, способ дает возможность объективизировать клиническую классификацию по уровню контроля над БА. Преимуществом заявленного способа является также его безопасность для пациента, и поэтому его можно проводить неоднократно независимо от периода заболевания. Источники информации 1. Глобальная стратегия лечения и профилактики бронхиальной астмы . Пересмотр 2006 / Под ред. А.Г. Чучалина. - М. Атмосфера, 2007. - 104 с. 2. Ярилин А.А., Донецкова А.Д. Естественные регуляторные -клетки и фактор 3 // Иммунология. - 2006. -3. - С. 176-188. 3..,.,.,.425-12// .. . - 2003. - . 111. - . 862-868. 4.// .. . - 2004. - . 113. - . 635-642. 5.-//. - 2004. - . 59. - . 640-643. 6.2277710 1, 2006. 7.2152617 1, 2000. 8. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ . - М. Медиасфера, 2002. - 312 с. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 7

МПК / Метки

МПК: G01N 33/50

Метки: бронхиальной, процесса, способ, астмы, воспалительного, оценки, активности, течения, контролем

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/7-14554-sposob-ocenki-aktivnosti-vospalitelnogo-processa-s-kontrolem-techeniya-bronhialnojj-astmy.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ оценки активности воспалительного процесса с контролем течения бронхиальной астмы</a>

Похожие патенты