Полифункциональный рекомбинантный штамм Burkholderia vietnamiensis, улучшающий минеральное питание сельскохозяйственной культуры, и способ его конструирования

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ, УЛУЧШАЮЩИЙ МИНЕРАЛЬНОЕ ПИТАНИЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ КУЛЬТУРЫ, И СПОСОБ ЕГО КОНСТРУИРОВАНИЯ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Бажанов Дмитрий ПетровичБажанова Алеся АлександровнаХуан ЮйЖанг КсиньянЛи Джишан(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт генетики и цитологии Национальной академии наук Беларуси(56)1020050034000 , 2005.2205976, 1998. БАЖАНОВ Д.П. и др. Доклады Академии наук Беларуси.- 1995.- Т. 39. 1.- . 84-87. БАЖАНОВ Д.П. Получение и характеристика генетически измененных ризобактерий Автореф. дис.- Минск,1993. - . 6-15..- 2004.- . 96.- . 6.- . 1245-1252.(57) 1. Полифункциональный рекомбинантный штамм 2097, улучшающий минеральное питание сельскохозяйственной культуры и обеспечивающий защиту от фитопатогенов. 2. Способ конструирования штаммапо п. 1, заключающийся в том, что в хромосому бактерииР 418 встраивают ген хитиназы 113 бактерии 113. 12707 1 2009.12.30 Изобретение относится к области генетического конструирования полезных полифункциональных ризосферных бактерий, способных увеличивать урожайность сельскохозяйственных культур за счет стимуляции их роста, улучшения минерального питания и защиты от фитопатогенов. Полифункциональный штаммможет быть использован в качестве продуцента при производстве биологических препаратов для растениеводства, а метод его конструирования - для усиления защитного действия других штаммов-продуцентов. Болезни растений являются одним из основных факторов снижения урожайности сельскохозяйственных культур. Использование химических средств защиты растений требует больших материальных затрат и сопровождается неблагоприятным экологическим эффектом. Кроме того, химические средства не всегда достаточно эффективны, а их широкое применение может привести к появлению устойчивых рас фитопатогенов. Задачей изобретения является защита прав на генетически сконструированный штамм 418-113 и метод его конструирования. Полифункциональный генетически сконструированный штамм 418-113 депонирован в Главном центре коллекций микробиологических культур Китая 11 июня 2007 г. под номером.2097. Прототипом штамма 418-113, в результате генетической модификации которого он был сконструирован, является полифункциональный штамм 418, он же Р 418. Штамм Р 418 был изолирован из корневой системы ячменя, росшего на участке, примыкающем к северо-восточной границе г. Минска, Республика Беларусь 1. Штамм Р 418 обладает способностью заселять корни различных сельскохозяйственных культур, фиксировать молекулярный азот, мобилизовать труднорастворимые фосфаты,стимулировать рост растений и сдерживать развитие ряда фитопатогенов 2-4. Штамм Р 418 депонирован в Главном центре коллекций микробиологических культур Китая 30 августа 2004 г. под номером.1212. Для получения штамма Р 418-113 ген хитиназы из 113 5 был встроен в хромосому штамма Р 418 в составе транспозона Т 5 с помощью самоэлиминирующейся плазмиды -113. По сравнению с исходным штаммом Р 418 сконструированный штамм Р 418-113 обладает более выраженной антагонистической активностью в отношении более широкого круга фитопатогенных грибов. Конструирование плазмиды -113. Ген хитиназы был изолирован изАр 113 5 с помощью полимеразной цепной реакции(5-3). Для приготовления реакционной смеси использовали буфер производства(Пекин) с добавлением 2,5 м 2, по 0,2 мМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, по 50 пкмолей каждого из праймеров,1 единицуДНК-полимеразы и 15 нг ДНК в качестве матрицы. ПЦР включала в себя денатурацию при 94 С в течение 5 мин 10 циклов 94 С - 1 мин, 39 С - 1,5 мин и 72 С 2 мин 25 циклов 94 С - 1 мин 41 С - 1,5 мин и 72 С - 2 мин, завершающая элонгация 72 С - 10 мин. Продукт амплификации и вектор -1 6 были обработаны рестриктазой , а затем лигированы. Продукты лигирования использовали для трансформации штамма . 5. Трансформанты отбирали на агаризованной среде с 25 мг/л ампициллина через 2 суток инкубации при 37 С. Присутствие рекомбинантной плазмиды 113 обнаруживали с помощью ПЦР (94 С в течение 5 мин 30 циклов 94 С - 1 мин,50 С - 1,5 мин и 72 С - 2 мин завершающая элонгация 72 С - 10 мин) при использовании праймеров 113- (53) и 113- (5-3). Продукты амплификации разделяли электрофорезом в 12707 1 2009.12.30 агарозном геле 7, о наличии свидетельствовало обнаружение ампликона размером около 1 тысячи пар оснований (фиг. 1, дорожки 1-3). Конструирование штамма 418-113. Перенос гена хитиназы в геном штамма Р 418 осуществляли методом трехродительских скрещиваний. Трансформанты . 5, содержащие рекомбинантную плазмиду-113, использовали в качестве донора в скрещиваниях со штаммом Р 418. В качестве помощника использовали штамм . 5, содержащий плазмиду 600. Ночные культуры донора, реципиента и помощника смешивали в соотношении 111 и осаждали центрифугированием. Осажденные бактерии переносили на агаризованную среду с канамицином и равномерно рассевали по ее поверхности с помощью шпателя. Устойчивые к канамицину трансконъюганты отбирали через 2 суток инкубации при 28 С. Полифункциональный штамм Р 418-113 был отобран в результате скрининга 76 полученных в трехродительских скрещиваниях трансконъюгантов по следующим параметрам 1. Проверка наличия гена хитиназы с помощью ПЦР при использовании праймеров 113- и 113- как при отборе трансформантов (см. Конструирование плазмиды-113). В результате отобран 31 трансконъюгант, несущий ген хитиназы из(фиг. 2). 2. Проверка наличия гена хитиназы с помощью блот-гибридизации по Саузерну по методу 7. Для обработки геномной ДНК трансконъюгантов использовали рестриктазу, в качестве зонда - фрагмент гена хитиназыАр 113, получаемый с помощью праймеров 113- и 113-. Проверка показала, что 27 из 31 отобранных на первом этапе трансконъюгантов штамма Р 418 содержат в хромосоме единичную копию гена хитиназы 113 (фиг. 3). 3. Оценка активности хитиназы. Культуры 27 отобранных трансконъюгантов были посеяны на поверхность агара с хитином. В результате у 8 из них был обнаружен высокий уровень хитинолитической активности, выявляемый по образованию зон просветления среды в результате разрушения суспензии хитина (фиг. 4). Количественное определение хитинолитической активности этих штаммов было проведено в соответствии с методикой 8. Ее результаты представлены в табл. 1. Таблица 1 Количественная оценка хитинолитической активности трансконъюгантовтрансконъюганта 12 33 35 37 38 39 40 41 Активность, ед. 0,56 1,64 0,93 1,84 0,64 1,22 0,40 0,85 Трансконъюгат 37, обладавший максимальной активностью, был отобран для дальнейшей работы, обозначен как 418-113 и депонирован как.2097. Антагонистическая активность штамма 418-113 ( .2097). Антагонистическая активность штаммов Р 418-113 ( .2097) и Р 418( .1212) была определена в отношении фитопатогенов,,,,,. . Для определения диск с мицелием патогена помещали в центр чашки Петри с картофельно-глюкозным агаром, на расстоянии 3 см от него с противоположных сторон наносили по 30 мкл ночной культуры исследуемых штаммов. Чашки инкубировали при 28 С в течение 5 суток. Зону ингибирования определяли как расстояние между краем псевдоколонии бактерий и краем мицелия гриба (фиг. 5, табл. 2). Присутствие гена хитиназы в штамме Р 418-113 ( .2097) привело к существенному (в 1,4-4,5 раза в зависимости от вида гриба) увеличению зон ингибирования роста мицелия,что свидетельствует о более высокой антагонистической активности этого штамма в отношении фитопатогенных грибов различной таксономической принадлежности. 3 12707 1 2009.12.30 Таблица 2 Сравнительная оценка антагонистической активности штаммов Р 418-113( .2097) и Р 418 ( .1212) Зона ингибирования, см Фитопатоген 418 ( 1212) Р 418-113 ( 2079)0,3 0,80,4 0,90,5 1,20,3 1,30,8 1,1.0,2 0,9 Биологическая характеристика штамма 418- 113 ( .2097). Была проведена оценка сохранения полезных биологических свойств у рекомбинантного штамма 418-113 ( .2097) способности мобилизовать труднорастворимые соединения фосфора и калия, а также заселять корневую систему после инокуляции семян. Мобилизацию фосфатов оценивали по образованию зон растворения при росте культур на среде, имеющей следующий состав (на 1 л) глюкоза - 10 г (4)2 О 4 - 0,5 г 0,2 г 472 - 0,3 г 472 - 0,03 г 442 - 0,03 г Са 3(РО 4)2 - 10 г, агар 15 г 7,5. Как видно из фиг. 6, штаммы Р 418 ( .1212) и Р 418-113( .2097) образовывали зоны растворения одинакового размера, что свидетельствует о сохранении способности к мобилизации фосфатов у рекомбинантного штамма Р 418-113 ( .2097). Мобилизацию калия оценивали по образованию зон растворения при росте культур на среде Александрова, имеющей следующий состав (на 1 л) глюкоза - 5 г 472 0,5 г еС 3 - 0,005 г 24 - 2,0 г СаСО 3 - 1 г аллюмосиликаты калия - 1 г, агар 15 г 7,5. Как видно из фиг. 7, штаммы Р 418 ( .1212) и Р 418-113 (.2097) образовывали зоны растворения одинакового размера, что свидетельствует о сохранении способности к мобилизации калия у рекомбинантного штамма Р 418-113( .2097). Способность заселять корневую систему ячменя определяли по методике, приведенной в 9. Через 2 недели после появления всходов популяции штаммов Р 418 (.1212) и Р 418-113 ( .2097) на корнях ячменя составляли 1,5-4,0106 КО на 1 г и не различались достоверно, что свидетельствует о сохранении способности заселять корни у рекомбинантного штамма 418-113 ( .2097). Фиг. 1 - обнаружение гена хитиназы в плазмиде -113 по амплификации фрагмента размером около 1,0 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.) (дорожки 1-3). М - маркеры молекулярной массы. Фиг. 2 - проверка наличия гена хитиназы в трансформантах по амплификации фрагмента размером около 1,0 тысячи пар нуклеотидов (т.п.н.). М - маркеры молекулярной массы. Фиг. 3 - проверка встраивания гена хитиназы в геном штаммаР 418 ( .1212) с помощью блот-гибридизации по Саузерну. Фиг. 4 - отбор трансформантов с высоким уровнем хитинолитической активности по образованию зон просветления среды в результате разрушения суспензии хитина. Фиг. 5 - тестирование ингибирования роста мицелия фитопатогенных грибов штаммами Р 418 ( .1212) и Р 418-113 ( .2097). Фиг. 6 - растворение суспензии Са 3(РО 4)2 штаммами Р 418 ( .1212) и Р 418113 ( .2097). Фиг. 7 - растворение алюмосиликатов калия штаммами Р 418 ( .1212) и Р 418-113 ( .2097). 4 12707 1 2009.12.30 Источники информации 1. Бажана Д.П., Рудава А.У., Троцк М.А. Вылучэннехарактарыстыка аэробных азотфксуючых бактэрый з рызыпланы дзкарослыхкультурных аднадольных раслн // Весц АН БССР. Сер. бял. навук. - 1991. -5. - С. 8-12. 2. Бажанов Д.П., Бажанова А.А., Окулич Л.А., Чернышев С.П. Азотфиксирующие ризосферные псевдомонады перспективы использования в агробиотехнологии. Сельскохозяйственная агробиотехнология. Мат. межд. науч.-практ. конф. - Горки. 14-17 декабря 1998. - С. 12-15. 3..,.,К... //3 . , , . . .15-19, 2002.. - . 406-408. 4. Бажанов Д.П., Бажанова А.А., Окулич Л.А., Стриенок Н.С. Первичное заселение корневой системы сельскохозяйственных культур азотфиксирующей бактерией.418 и ее - и -производными // Весц НАН Беларус. Сер. бял. навук. 2005. -4. - С. 48-50. 5.113(113) ,. ( . 661650) // // 6..,.,., -5,,. // . . - 1990. - .72. - . 6568-6572. 7.., . . .,.,. -, 1989. 8..,.,. - 2004. - . 85. - . 80-88. 9. Бажанов Д.П., Бажанова А.А., Окулич Л.А., Стриенок Н.С. Первичное заселение корневой системы сельскохозяйственных культур азотфиксирующей бактерией.418 и ее - и -производными // Весц НАН Беларус. Сер. бял. навук. 2005. -4. - С. 48-50. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6

МПК / Метки

МПК: C12N 1/21, A01N 63/00

Метки: улучшающий, способ, рекомбинантный, минеральное, vietnamiensis, конструирования, культуры, питание, сельскохозяйственной, burkholderia, полифункциональный, штамм

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/6-12707-polifunkcionalnyjj-rekombinantnyjj-shtamm-burkholderia-vietnamiensis-uluchshayushhijj-mineralnoe-pitanie-selskohozyajjstvennojj-kultury-i-sposob-ego-konstruirovaniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Полифункциональный рекомбинантный штамм Burkholderia vietnamiensis, улучшающий минеральное питание сельскохозяйственной культуры, и способ его конструирования</a>

Похожие патенты