Штамм гриба Inonotus obliquus БИМ F-350 Д – продуцент меланина, обладающий антимутагенными свойствами

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Бабицкая Валентина Григорьевна Щерба Виктор Васильевич Иконникова Наталья Валерьевна Пучкова Татьяна Антоновна Филимонова Татьяна Васильевна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт микробиологии Национальной академии наук Беларуси Изобретение относится к биотехнологии, может быть использовано в фармацевтической промышленности для получения медицинских препаратов, в косметической промышленности для изготовления кремов, лосьонов, тоников, в пищевой промышленности для разработки биологически активных добавок и касается нового штамма - продуцента меланина. Известен целый ряд культур микроорганизмов, синтезирующих меланиновый пигмент в небольших количествах, -,Малама А.А. и Касперович Т.В. Изучение пигментов грибови// Микология и фитопатология. - Т. 10. - Ленинград, 1976. - С. 422,,Малама А.А., Тернов В.И., Храменко Г.Б., Данильчик Н.И. Влияние меланиновых пигментов, образуемых микроорганизмами, на резистентность мышей к рентгеновскому облучению // Радиобиология. - Т. 12. - М. 1972. - С. 289. Для промышленного производства культуры интереса не представляют. Известен меланинобразующий штамм гриба-396 1, предложенный авторами для связывания тяжелых металлов при очистке сточных вод. Штамм не находит практического применения, так как имеет невысокую меланинобразующую способность 1. 10670 1 2008.06.30 Известно использование грибадля профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний 2, 3. Известно биостимулирующее средство, одним из компонентов которого является березовый гриб (чага,) 4. Известен состав, обладающий противоопухолевым, гепатопротекторным и иммуностимулирующим действием, в котором чага используется в качестве добавки к листовому или гранулированному чаю 5. Однако во всех этих способах используются плодовые тела чаги, произрастающие на деревьях, а не чистая культура, выращенная в стерильных глубинных условиях. Плодовые тела не являются продуцентами меланинов. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является штамм грибаБМП-97/2, предложенный авторами для производства меланина 6. Гриб является факультативным анаэробом, растет в интервале температур от 18 до 40 С. Оптимальная температура для роста культуры - 28 С, биосинтеза меланиа - 37 С. Оптимальный рН - 6,50,5. Синтезирует меланин внутри клеток и внеклеточно. В качестве источника углерода гриб использует большинство сахаров (глюкоза, сахароза, мальтоза, арабиноза), не усваивает этиловый спирт. Коагулирует и пептонизирует молоко, разжижает желатину. Обладает протеазной и оксидазной активностью. Гриб выращивают на косяках (сусло-агар) 14 сут., суспензию спор получают 14 сут. Ферментацию культуры ведут в анаэробных условиях при температуре 371 С в течение 20 сут. Получают 12 г меланина технического, после растворения которого в 40 растворе едкого натра, нейтрализации и сушки получают 8 г субстанции меланина. Данный штамм взят за прототип. Однако штамм имеет ряд недостатков длительный процесс получения посевного спорового материала гриба (два пересева по 14 сут.) - всего 28 сут. длительная ферментация культуры гриба (20 сут.) анаэробные условия культивирования, что усложняет технологичность процесса выращивания культуры синтез меланина при высокой температуре - 371 С использование спорообразующей культуры, что загрязняет окружающую среду и может вызвать аллергию у работающих. Задачей изобретения является получение нового штамма, более технологичного и продуктивного, способного расти при более низких температурах (ниже 37 С), образовывать меланинсодержащую субстанцию в более короткие сроки, а также обладающего новыми для данного вида и рода гриба свойствами. Предлагаемый штаммБИМ -350 Д выделен в виде тканевых изолятов плодовых тел, произрастающих в Минской области, Пуховичском районе, получен путем естественной селекции и депонирован в Коллекции непатогенных микроорганизмов ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси, коллекция мицелиальных грибов под регистрационным номером БИМ -350 Д. Культура также поддерживается в коллекции мицелиальных грибов лаборатории экспериментальной микологии ГНУ Институт микробиологии НАН Беларуси. Штамм хранится при 4-6 С на сусло-агаре. Культурально-морфологические свойства. Штамм .БИМ -350 Д является аэробом, способен расти в интервале температур 18-30 С, оптимальная температура для роста 24-25 С, синтеза меланиновых пигментов - 25-27 С. Оптимальные значения рН 6,0-7,0. Характеризуется синтезом экзо- и эндомеланинов. При культивировании на чашках Петри с сусло-агаром при температуре 24-25 С колонии слаборадиальные, мицелий войлочный, густой, пушистый, светло-желтой окраски(у молодых культур - белого цвета), по мере старения приобретает охристую, затем ржа 2 10670 1 2008.06.30 во-коричневую окраску. Реверзум темнопигментированный по всей поверхности. Колонии медленнорастущие, скорость роста - 2-2,3 мм/сут. Полное зарастание чашки наблюдается к 20-23 сут. Генеративные гифы септированные, тонкостенные, гиалиновые до желтоватых, ветвящиеся, переходящие в толстостенные, ржаво-бурые, параллельно расположенные гифы. Физиолого-биохимическая характеристика. Культура активно усваивает в качестве источника углерода моносахариды (глюкоза, галактоза, ксилоза, фруктоза, арабиноза), дисахариды (сахароза, мальтоза, целлобиоза, лактоза), полисахариды (крахмал), полиолы(манит, сорбит). В качестве источников азота используют неорганические 4)24, 43, 4,(4)24, 424, 3, 3) и органические (пептон, кукурузный экстракт) соединения. Штамм не является зоо- и фитопатогенным. Токсикологические исследования штамма проводились на лабораторных животных. При изучении острой пероральной токсичности сухого глубинного мицелия гриба .БИМ -350 Д установлено, что мицелий в максимальной дозе для крыс 3,75, для мышей - 10,0 г/кг практически нетоксичен (ЛД 50 определить не удалось). Образец глубинного мицелия гриба .БИМ -350 Д не обладает кожно-раздражающим действием. Изучение мицелия гриба .БИМ-350 Д в хроническом эксперименте при ежедневном пероральном введении в течение 30 сут. сухого мицелия в дозе 100 мг/кг не выявило каких-либо существенных функциональных и структурных нарушений со стороны жизненно важных систем организма животных. Таким образом, глубинный мицелий базидиального гриба .БИМ -350 Д(чага) является безвредным для организма. На модели ДНК фагаустановлено предотвращение меланинсодержащей субстанцией .БИМ -350 Д повреждений ДНК фагапродуктами пероксидазного окисления дианизидина. Исследования антимутагенной активности меланинсодержащей субстанции на самцах мышей линиипоказало, что внутрибрюшинное введение ее в дозе 50 мг/кг веса животного снижает уровень радиоиндуцированных транслокаций в сперматоцитах в 2 раза,что свидетельствует о высоких антиоксидантных и генопротекторных свойствах меланинсодержащей субстанции гриба .БИМ -350 Д. Сведения, подтверждающие образование меланинсодержащей субстанции штаммом .БИМ -350 Д на различных питательных средах. Пример 1. Культуру гриба .БИМ -350 Д выращивают на скошенном сусло-агаре при 23-25 С в течение 7-10 сут., затем переносят стерильной лопаткой или шпателем в качалочные колбы (1 косяк в 1 колбу) вместимостью 0,7 л со 150 мл стерильной среды - пивное неохмеленное сусло 5 Б, рН 6,0-7,0. Штамм культивируют на качалке (160-180 об/мин) при 25-27 С в течение 7-8 сут., полученный посевной материал используют для засева посевной среды следующего состава (г/л) глюкоза 30 Н 2 РО 4 1,0 2 НРО 4 1,0 4 0,25(4)4 1,4 пептон 3,0 452 0,08 кукурузный экстракт 2,0 мл вода дистиллированная до 1,0 л. Культивирование ведут в колбах на качалке 8-10 сут. или в ферментере (5-6 сут.),аэрация - 0,325 г О 2/лч, начальный рН среды - 6,0-7,0, количество посевного материала 15 . 3 10670 1 2008.06.30 Получают 10-11 г/л меланинсодержащей биомассы, которую экстрагируют 40 раствором едкого натра. После хроматографической очистки и сушки получают 6 г/л субстанции меланина. Выход меланина из культуральной жидкости (осаждение ведут соляной кислотой до рН - 1,0) - 1,0 г/л. Общий выход субстанции меланина - 7,0 г/л. Пример 2. Выращивание гриба и получение меланинсодержащей биомассы осуществляется аналогично изложенному в примере 1. В качестве питательной среды используется следующая (г/л) глюкоза Н 2 РО 4 2 НРО 4 4(4)24 пептон 452 тирозин кукурузный экстракт вода дистиллированная Выход меланинсодержащей биомассы - 12 г/л. Выход меланинсодержащей субстанции - 7,2 г/л. Выход меланина из культуральной жидкости - 1,3 г/л. Общий выход субстанции меланина - 8,5 г/л. Пример 3. Выращивание гриба осуществляется аналогично изложенному в примерах 1, 2. В среду вносится тиамин в количестве 300 мкг/л. Состав питательной среды (г/л) глюкоза 30 Н 2 РО 4 1,0 2 НРО 4 1,0 4 0,25(4)24 1,4 пептон 3,0 452 0,08 тирозин 0,2 тиамин 300 мкг кукурузный экстракт 2,0 мл вода дистиллированная до 1,0 л. Выход меланинсодержащей биомассы - 12,5 г/л. Выход меланинсодержащей субстанции - 7,5 г/л. Выход меланина из культуральной жидкости - 1,4 г/л. Общий выход субстанции меланина - 8,9 г/л. Меланин .БИМ -350 Д - пигмент полифенольной природы. Порошок от темно-коричневого до черного цвета. Умеренно растворим в воде, хорошо - в щелочах. Содержит 38,2 углерода, 50,5 кислорода, 5,5 водорода, 5,8 азота, алифатические(- ОН), фенольные, карбонильные и карбоксильные группы. Молекулярная масса находится в пределах 52-60 ка, содержится незначительное количество пигмента с молекулярной массой 100-120 к. Таким образом, предлагаемый новый штамм имеет более высокую физиологическую активность, характеризуется высоким выходом меланинсодержащей субстанции (табл. 1). 4 10670 1 2008.06.30 Таблица 1 Предлагаемый новый штамм Прототип Длительность получения субстанции меланина. Весь цикл выращивания гриба - 24-30 сут. Весь цикл выращивания гриба - 48 сут. 8-10 сут. - выращивание на косяках, 8-10 сут. 14 сут. - выращивание на косяках, 14 сут. ферментация в колбах - получение инокулюма,на плотных средах, 20 сут. - в колбах. 8-10 сут. культивирования - получение субстанции. Температура культивирования - 25 С. 37 С. Общий выход субстанции меланина 8,0 г/л 8,5-8,9 г/л. Существенно и то, что новый штамм является высшим базидиомицетом, вегетативный мицелий не образует спор, что очень важно с экологической точки зрения.- спорообразующая культура. Поскольку основой субстанции является поверхностный мицелийспоры, велика опасность спор для здоровья человека (аспергиллезы). У предлагаемого штамма обнаружены новые свойства генопротекторная, антимутагенная и фагоцитарная (иммуностимулирующая) активности, сорбционная способность. С целью изучения генопротекторных свойств меланинсодержащей субстанции.БИМ -350 Д исследовалось влияние ее на процесс повреждения ДНК фагапродуцентами пероксидазного окисления дианизидина (ДА). При концентрации ДА 310-5 М наблюдается 100 повреждение ДНК. При концентрации в реакционной смеси меланинсодержащей субстанции 6,0 мкг/мл число перекрестных сшивок ДНК-ДНК уменьшалось в 2 раза. В концентрации 20 мкг/мл субстанция полностью предотвращала этот процесс. Антимутагенная активность субстанции меланина проверена на мышах. Внутрибрюшинное введение субстанции в дозе 50 мг/кг снижает уровень радиоиндуцированных транслокаций в сперматоцитах в 2 раза (табл. 2). Таблица 2 Антимутагенная активность субстанции меланина Количествореципрок-уровень Вариант ных транс- значимометафазных реципрокных семенников локаций сти клеток транслокаций Интактные мыши 8 1027 1 0,09 Облученные дозой 8 665 21 3,150,58 4 Гр 4 Гртехнический меланин 8 516 10 1,931,32 5,57-350 Д В опытахмеланинсодержащая субстанция, полученная из глубинного мицелия гриба, стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов по отношению кв концентрации 100 мкг/мл. Субстанция меланина характеризуется высокими сорбирующими свойствами по отношению к ионам тяжелых металлов. Сорбционная емкость, мг/г Р 2(свинец) 2,8 2 С (медь) 2,9 2(цинк) 1,8 2(никель) 1,6. 5 10670 1 2008.06.30 Полученные результаты свидетельствуют о высоком биологическом действии антимутагенных, генопротекторных и сорбционных свойствах меланина гриба .БИМ-350 Д в условияхи. Эти свойства субстанции меланина могут быть использованы при создании антиканцерогенных и иммуностимулирующих препаратов. Источники информации 1. А.с. СССР 1063834 А, МПК С 12 15/00 С 02 3/34 С 12 1/645, 1983. 2. Патент 93028693, МПК А 61 35/78, 1995. 3. Патент 20767282, МПК А 61 35/78, 1997. 4. Патент 97118466, МПК А 61 35/78, 1999. 5. Патент 2002130119, МПК А 61 35/78, 2004. 6. Патент 5057 С 1, МПК С 12 1/14, 1999. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 6

МПК / Метки

МПК: C12N 1/14, C12P 19/00

Метки: меланина, обладающий, бим, f-350, свойствами, obliquus, продуцент, штамм, inonotus, гриба, антимутагенными

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/6-10670-shtamm-griba-inonotus-obliquus-bim-f-350-d-producent-melanina-obladayushhijj-antimutagennymi-svojjstvami.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Штамм гриба Inonotus obliquus БИМ F-350 Д &#8211; продуцент меланина, обладающий антимутагенными свойствами</a>

Похожие патенты