Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОНЪЮГАТ 24-ЭПИКАСТАСТЕРОНА С БЫЧЬИМ СЫВОРОТОЧНЫМ АЛЬБУМИНОМ В КАЧЕСТВЕ ИММУНОГЕНА(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Хрипач Владимир Александрович Свиридов Олег Васильевич Литвиновская Раиса Павловна Прядко Андрей Георгиевич Драч Светлана Васильевна Матвеенцев Виталий Демидович Демченко Наталья Ивановна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(57) Конъюгат 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы где БСА - бычий сывороточный альбумин в качестве иммуногена. Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином формулы где БСА - бычий сывороточный альбумин, который может быть использован в качестве иммуногена для получения антител, специфичных к 24-метилбрассиностероидам. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений 1. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко 10-5-10-9 и менее. В очень малых концентрациях они проявляют и свое биологическое действие, поэтому методы анализа брассиностероидов должны обладать высокой чувствительностью, избирательностью, простотой в исполнении и быть доступными. Развитие в последнее время методов, основанных на использовании антител, в частности иммуноферментного анализа, требует наличия иммуногена. Брассиностероиды сами по себе не обладают иммуногенностью, поэтому для получения иммунного ответа у животных они могут быть использованы для иммунизации в виде конъюгатов с белками(через соответствующие гаптены). Известен конъюгат брассинолида с БСА формулы в котором связь брассиностероида с белком осуществляется через 3-гидроксигруппу 8. К недостаткам данного конъюгата следует отнести, прежде всего, связывание 3-гидроксигруппы, которая относится к группам, ответственным за биологическую активность брассиностероидов, что может сказаться отрицательно на специфичности вырабатываемых животными антител. Кроме того, наличие в молекуле лабильной сложноэфирной связи между молекулой стероида и остатком янтарной кислоты делает этот конъюгат нестабильным 3. Наиболее близким к заявляемому является конъюгат кастастерона с БСА формулы который предложен авторами для радиоиммуноанализа брассиностероидов 4. Конъюгат получен на основе 24-метилбрассиностероида - кастастерона, но не позволил получить антитела, специфичные даже к этой группе брассиностероидов. В научной и патентной литературе отсутствуют упоминания о конъюгатах брассиностероидов, которые были получены и могли бы быть использованы для получения антител, специфичных к 24-метилбрассиностероидам, конкретно к 24-эпикастастерону и эпибрассинолиду. Целью изобретения является конъюгат 24-эпикастастерона и бычьего сывороточного альбумина, позволяющий получить высокоспецифические антитела к 24-метилбрассиностероидам. Поставленная цель достигается заявляемым соединением , которое получают взаимодействием -оксисукцинимидного эфира 6 карбоксиметоксиламиноксима 24-эпикастастерона(гаптена) с бычьим сывороточным альбумином в водно-диоксановом растворе (рН 8,5),очисткой путем диализа и лиофилизацией конъюгата. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1 Растворяют 0,11 г (0,21 ммоль) (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил 5-холест-6-илиденаминоокси уксусной кислоты и 0,019 г (0,165 ммоль) -оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана, охлаждают до 5 и при перемешивании добавляют раствор 0,029 г (0,14 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 и 20 часов при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают,фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным 24, упаривают. Выход -сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон 0,105 г (92 ). Маслообразный продукт, спектр 10,66 (с, 3 Н, 18-), 0,74 (с, 3 Н,19-), 0,8-1,00 (, 12 Н, 21-, 26-, 27- и 28-), 2,88 (с, 4 Н, 2-2), 3,063,24 (, 2), 3,28-3,38 (, 2), 3,78 (, 1), 3,92-4,00 (, 1), 4,88 (, 2 Н, -О-СН 2-СО). ИК спектр (пленка) 3440, 2950, 2880, 1755, 1730, 1725, 1390, 1215, 1090. Растворяют 72 мг (101,55 мкмоль) -оксисукцинимидного эфира 6-О-карбоксиметоксиламиноксима 24-эпикастастерона в 7 мл диоксана и добавляют 0,1 г (1,4 мкмоль) БСА в 7 мл 0,1 раствора бикарбоната натрия (рН 8.3). Перемешивают в течение 20 часов при комнатной температуре. Реакционную смесь подвергают диализу при 20 против дистиллированной воды в течение 36 часов, затем против 1 суспензии активированного угля в воде 20 часов, лиофилизуют и замораживают при температуре -20 . Содержание гаптена в конъюгате, определенное спектрофотометрически, составляло около 25 моль гаптена на 1 моль белка. 3 9770 1 2007.10.30 Заявляемый конъюгат получают с практически количественным выходом и высокой степенью посадки антигена, что обусловлено стабильностью соединения как в процессе синтеза, так и очистки и выделения. Синтезированный конъюгат используют для получения антител, специфичных к 24 метилбрассиностероидам (24-эпибрассинолид и 24-эпикастастерон), что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 2 Группу из десяти кроликов иммунизируют конъюгатом эпикастастерон-БСА с плотностью посадки 25 молекул стероида на 1 молекулу белка. Каждому кролику вводят подкожно в 10-15 точек спины по 1 мг конъюгата, предварительно растворенного в 0,5 мл фосфатно-буферного раствора поваренной соли (рН 7,4) и эмульгированного в равном объеме полного адъюванта Фрейнда. Интервалы между инъекциями составляли 3 недели. Иммунизацию продолжают в течение 6 месяцев, осуществляя периодический отбор проб крови из ушной вены животных. Полученные образцы сыворотки тестируют на наличие связывающей способности в отношении 24-эпикастастерона и определяют их титры и значения констант ассоциации (Ка). Титр определяют как рабочее разведение антисыворотки, обеспечивающее максимальную чувствительность тест-системы при таком связывании конъюгата, которое позволяет построить калибровочный график в диапазоне 2,50,2 . Таблица 1 Характеристики антисывороток, полученных при иммунизации животных конъюгатом 24-эпикастастерона с БСА Антисыворотка Титр Ка 109 М-1 1,5 110000 А 2 1,9 120000 Определение оптимального титра антисыворотки для применения в ИФА показало,что ее разбавление в 20000 раз позволяет обеспечить приемлемые условия определения как эпикастастерона, так и эпибрассинолида, проявивших, как и предполагалось, сравнимые параметры связывания с антителами. Специфичность. Перекрестная реакция антител к 24-эпикастастерону с брассиностероидами и стероидами других классов приведена в табл. 2. Таблица 2 Кросс-реактивность антисыворотки А 2 с различными стероидами Стероид Связывание по отношению к Э 1. Эпикастастерон 100 2. Эпибрассинолид 80-100 3. Гомокастастерон 15,0 4. 22,23-эпикастастерон 7,2 5. 22,23-эпибрассинолид 6,4 6. Кастастерон 3,0 7. Брассинолид 0,45 8. Гомобрассинолид 0,37 9. Экдистерон 0,3 10. (22,23)-22,23-дигидроксистигмаст-2-ен-6-он 0,05 11. 22,23-гомокастастерон 0,04 12. Стигмастерин 0,01 13. 24-эпиэргост-2-ен-6-он 0,01 0,01 14. 2,3-дигидроксиэргост-6-он 15. Кампастерин 0,01 4 Продолжение табл. 2 Связывание по отношению к Э 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 Заявляемый конъюгат получается с высоким выходом, стабильностью, высокой степенью посадки гаптена на белок, обеспечивает необходимую иммуногенность и позволяет получать антитела, специфичные к 24-эпибрассинолиду и 24-эпикастастерону. Источники информации 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск Навукатэхнка, 1993. - 288 с. 2.. ,.. ... (.) - 1988. . 86. - . 113. 3., // . . . -1985. - . 81. - .245. 4..,.,.,.,. // .. 1990. - . 9. - . 151. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5

МПК / Метки

МПК: C07J 41/00

Метки: бычьим, сывороточным, качестве, 24-эпикастастерона, иммуногена, альбумином, конъюгат

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/5-9770-konyugat-24-epikastasterona-s-bychim-syvorotochnym-albuminom-v-kachestve-immunogena.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Конъюгат 24-эпикастастерона с бычьим сывороточным альбумином в качестве иммуногена</a>

Похожие патенты