Способ прогнозирования риска рецидива злокачественной опухоли

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА РЕЦИДИВА ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр детской онкологии и гематологии и иммунологии(72) Авторы Савицкая Татьяна Владимировна Киселев Леонид Петрович Липай Наталья Валерьевна Алейникова Ольга Витальевна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр детской онкологии и гематологии и иммунологии(57) Способ прогнозирования риска рецидива злокачественной опухоли, заключающийся в том, что в образце опухоли оценивают уровень экспрессии генов -2, 165 и 189, рассчитывают коэффициент 165/189 и прогнозируют высокий риск развития рецидива опухоли при значении уровня экспрессии гена -2 менее 0,8 и значении коэффициента 165/189 менее 0,9 или низкий риск развития рецидива опухоли при значении уровня экспрессии гена -2, равном или более 0,8, и/или значении коэффициента 165/189, равном или более 0,9. Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии, а именно к способу определения молекулярных маркеров ангиогенеза как факторов прогноза риска рецидива у пациентов со злокачественными солидными опухолями. Ангиогенез - процесс роста новых сосудов, регулируемый рядом клеточных факторов. Он является необходимым условием для роста опухоли и метастазов, поэтому ингибирование процессов опухолевого ангиогенеза - многообещающий подход к лечению онкологических заболеваний. Так как молекулярные маркеры (мРНК) ангиогенеза также экспрессируются в здоровом организме, то для определения уровня их экспрессии при патологии и клинического использования необходим количественный метод. Известны способы определения молекулярных маркеров ангиогенеза с применением технологии количественной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени с использованием в качестве маркеров уровней экспрессии мРНК ряда факторов, регулирующих ангиогенез 1, 2. Авторами показана корреляция между уровнем мРНК ангиогенных факторов и опухолевой прогрессией, временем возникновения рецидива и выживаемостью пациентов. 18697 1 2014.10.30 Недостатком является недостаточная клиническая значимость способов, связанная как с особенностями патогенеза исследуемого вида опухоли, так и с прогностической значимостью выбранных маркеров. Наиболее близким, принятым за прототип, является способ определения экспрессии мРНК маркера ангиогенеза фактора роста эндотелиальных клеток , а именно его транскриптов (сплайс-вариантов) 165, 189 и(теломеразной обратной транскриптазы) в карциноме молочной железы и неопухолевой ткани 3. В работе определяли экспрессию транскриптов методом количественной ПЦР с использованиемтехнологии. Проанализированы уровни соотношений (коэффициентов) экспрессии транскриптов 165/189 и , показаны различия в экспрессии в опухолевой и неопухолевой ткани, однако авторы не оценили прогностическую значимость способа и комбинации нескольких маркеров у онкологических пациентов. Задача настоящего изобретения - создание комбинации молекулярных маркеров ангиогенеза для прогноза риска рецидива злокачественной опухоли у пациента. Поставленная задача достигается тем, что для осуществления способа используют образец опухолевой ткани пациента со злокачественной опухолью. В нем определяют экспрессию генов (мРНК) ингиботора пути тканевого фактора (-2,) и транскриптов фактора роста сосудов (,) 165 и 189 на момент постановки диагноза методом относительной количественной ПЦР (полимеразная цепная реакция) в реальном времени. Комплексное сочетание уровней этих двух маркеров позволяет определить у пациента группу риска развития рецидива. Способ осуществляется следующим образом. Из образцов опухолевой ткани пациента выделяют РНК, на которой в реакции обратной транскрипции синтезируют кДНК. Полученную кДНК используют в качестве матрицы в реакции относительной количественной ПЦР. Принцип выполнения методики относительной количественной ПЦР заключается в следующем в каждом образце мишенями являются мРНК (конвертируемые в кДНК) изучаемых генов, а референс-геном - кДНК гена глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (, 3- ) мишень и референс-ген амплифицируют в отдельных пробирках для получения относительных стандартных кривых используют метод стандартных разведений. Стандартные кривые в каждой реакции для каждого гена строят по четырем 10-кратным разведениям кДНК (от 100 до 10-3), полученным из перевиваемых клеточных линийдля генов -2 идля , 165 и 189. Полученные стандартные кривые используют для расчета относительного количества продуктов амплификации исследуемых генов ис учетом эффективности реакции. Стандартные кривые оценивают математически с использованием программного обеспечения термоциклера для ПЦР в реальном времени по следующим показателям коэффициент корреляции ( ), который отражает корреляцию показателя СТ разных разведений и должен быть выше 0,990 эффективность ПЦР ( ) должна быть в пределах 90-110 наклон стандартной кривойможет варьировать в пределах 3,0-3,6. Для амплификации гена -2 и референс-генаиспользуют праймеры и зонды в виде коммерческих наборов (,,США). Для амплификации сплайс-вариантов 165 и 189 используют пробы и праймеры, указанные в работе. 4. Для ПЦР используют набор для проведения количественной ПЦР с применениемтехнологии, в состав которого входит фермент урацилгликозилаза, позволяю 2 18697 1 2014.10.30 щий предотвратить повторную реамплификацию продуктов при перекрестной контаминации продуктов ПЦР. Собственно ПЦР проводят, используя следующие условия 20 - 10 мин, 42 - 45 мин,99 - 3 мин. Количество циклов - 50. Амплификацию и уровень экспрессии гена определяют с использованием прибора и программного обеспечения(, США). Программное обеспечение используемого прибора на основе построенной стандартной кривой рассчитывает ненормализованные уровни экспрессии генов, выраженные в условных единицах. Нормализуют значения экспрессии исследуемых генов делением на значение экспрессии референс-гена 2 ИГнИГх/,где ИГн - нормализованное значение экспрессии исследуемого гена в образце ИГх ненормализованное значение экспрессии исследуемого гена в образце- значение экспрессии референс-гена в образце. Определяют коэффициент 165/189 делением нормализованного значения экспрессии сплайс-варианта 165 на значение нормализованного значения экспрессии сплайс-варианта 189. При комплексном сочетании этих двух признаков в качестве факторов прогноза риска рецидива определяют группы прогноза при одновременных значениях -2 менее 0,8 значение коэффициента 165/189 менее 0,9 - плохой прогноз при значениях -2 более или равно 0,8 и/или значение коэффициента 165/189 более или равно 0,9 - хороший прогноз. Преимуществом заявляемого способа является возможность клинического использования, так как для его выполнения применяют оборудование и технологии, широко используемые в современных диагностических лабораториях. Отличительные признаки заявляемого в качестве изобретения способа использование комбинации двух факторов -2 и 165/189 использование в качестве одного из двух факторов коэффициента соотношений 165/189 определение конкретных уровней экспрессии мРНК используемых факторов. Предлагаемый способ позволяет выявлять группы риска развития рецидива среди детей со злокачественными опухолями, в первую очередь у пациентов с локальной формой заболевания,назначать дополнительное лечение, обоснованно использовать таргетную терапию у пациента с локальной формой заболевания, но группой высокого риска модифицировать план лечения для пациента из группы высокого риска на ранних этапах, что позволяет индивидуализировать терапию и увеличить показатели безрецидивной выживаемости. Эффективность применения способа иллюстрируется следующими фигурами. На фиг. 1 приведена безрецидивная выживаемостьсреди детей со злокачественными опухолями (костными и мягкотканными). Для группы высокого риска 1 (по критериям 0,8 -20,9 165/189) она составила 23,08,0 против 80,09,0 для группы низкого риска 2 ( 0,8 -2 и/или 0,9 165/189)(р 0,00008). При этом первую группу составили 26 пациентов, из них 16 с рецидивом,без рецидива - 10, медиана наблюдения составила 13,65 мес. Во вторую группу вошли 21 пациент, без рецидива - 19, с рецидивом - 2, медиана наблюдения - 24,45 мес. На фиг. 2 приведена безрецидивная выживаемость среди детей с костными опухолями(саркомой Юинга и остеогенной саркомой) и локальной формой заболевания. Для группы высокого риска 1 (по критериям 0,8 -20,9 165/189) она составила 41,013,0 против 90,08,0 для группы низкого риска 2 ( 0,8 -2 и/или 3 18697 1 2014.10.300,9 165/189) (р 0,0235). Первую группу составили 14 пациентов, из них 6 с рецидивом, без рецидива - 8, медиана наблюдения составила 14,03 мес. Во вторую группу вошли 13 пациентов, без рецидива - 12, с рецидивом - 1, медиана наблюдения составила 23,05 мес. На фиг. 3 приведена безрецидивная выживаемость среди детей с саркомой Юинга и локальной формой заболевания. Для группы высокого риска 1 (по критериям 0,8 20,9 165/189) она составила 40,019,0 против 100,000,0 для группы низкого риска 2 ( 0,8 -2 и/или 0,9 165/189) (0,0377). Первую группу составили 7 пациентов, из них 3 с рецидивом, без рецидива - 4, медиана наблюдения 14,03 мес. Во вторую группу вошли 128 пациентов, без рецидива - 128, с рецидивом - 0,медиана наблюдения составила 23,05 мес. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/68, G01N 33/48

Метки: риска, опухоли, рецидива, прогнозирования, способ, злокачественной

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/5-18697-sposob-prognozirovaniya-riska-recidiva-zlokachestvennojj-opuholi.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ прогнозирования риска рецидива злокачественной опухоли</a>

Похожие патенты