Челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях рода Pseudomonas или Escherichia coli и способ его конструирования

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(54) ЧЕЛНОЧНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Василенко Светлана Леонидовна Хамза Фади Джауд Титок Марина Алексеевна(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет(57) 1. Челночный векторразмером 4822 п.н. для молекулярного клонирования в бактериях родаили, содержащий -ген и -сайт плазмиды 267 группы несовместимости Р-9, 1-репликон плазмиды 1, маркер канамицинрезистентности, полилинкер с единичными сайтами для клонирования, ,, 65 ,,,,,,,, расположенный в-гене, позволяющий осуществлять встраивание чужеродного фрагмента ДНК размером около 8000 п.н., вызывая инактивацию -гена, и -сайт, обеспечивающий перенос вектора путем конъюгации. 2. Способ конструирования челночного вектора по п. 1, заключающийся в том, что ДНК плазмиды 18 гидролизуют рестриктазой , обрабатывают фрагментом Кленова и соединяют ДНК-лигазой с амплифицированной в полимеразной цепной реакции последовательностью -области плазмиды 267 размером 1088 п.н., обработанной фрагментом Кленова. 14736 1 2011.08.30 Предлагаемое техническое решение относится к химии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в биотехнологии для клонирования чужеродных молекул ДНК в системе грамотрицательных бактерий рода- . . Для молекулярного клонирования в бактериях родасоздано два типа челночных векторов. Все они способны поддерживаться в бактериях .(за счет областей плазмид 322, 19, 15, 7 или 16) и отличаются типом репликона, обеспечивающего наследование в клетках 1-10. Первый тип векторов создан на основе плазмиды 1010 группы несовместимости Р-4 1-7. Несмотря на присутствие репликона широкого круга хозяев, некоторые из них не способны передаваться и наследоваться в клетках бактерий 4-6. Кроме того, все они характеризуются большими размерами (от 11,6 до 16,9 т.п.н.), что осложняет работу с ними при постановке экспериментов, особенно со встроенными фрагментами чужеродной ДНК значительного размера. Для введения данного типа векторов в клетки бактерийв основном применялся метод конъюгации с использованием мобилизующей плазмиды группы несовместимости -1, которая передается совместно с векторными молекулами в клетки реципиентов и затрудняет дальнейший анализ трансконъюгантного потомства. Недостатком всех векторов данного типа является принцип отбора вставок чужеродных фрагментов ДНК, основанный на инактивации маркеров антибиотикорезистентности. Многие сайты, пригодные для клонирования, не могут быть использованы, поскольку не обеспечивают получение конструкций с искомым фенотипом. Второй тип челночных векторов создан на основе репликонов узкого круга хозяев 810. Основным недостатком этих векторных систем является способность их наследоваться только в одном виде псевдомонад. Например, вектор 1 размером 4,87 т.п.н., содержащий -область плазмиды 1614, имеет удобную систему отбора вставок(инактивация -гена), но способен наследоваться только в бактериях . , в клетки которых может вводиться путем трансформации или электропорации (не содержит сайта) 9. Задачей изобретения является создание челночного вектора для молекулярного клонирования в бактериях родаи . , позволяющего клонировать в указанных организмах фрагменты чужеродной ДНК, размером более 8 т.п.н., и содержащего систему, позволяющую вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в клетках . . Технический результат состоит в конструировании челночного вектора, содержащего 1-репликон, обеспечивающий наследование в бактериях . , и -областъ плазмиды широкого круга хозяев 267 группы несовместимости Р-9, обеспечивающей поддержание в клетках бактерий рода о. Поставленная задача решается тем, что с помощью генно-инженерных манипуляций конструируют вектор для молекулярного клонирования, способный эффективно вводиться и стабильно поддерживаться в бактериях родаи . . Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем,что в функционально незначимую область вектора 18 (размером 3793 п.н.), содержащего 1-репликон, маркер канамицинрезистентности, а также полилинкер с единичными сайтами для клонирования, была осуществлена вставка -области плазмиды 267 группы несовместимости Р-9, обеспечивающая поддержание векторных молекул в широком круге бактерий рода . Сущность изобретения поясняется на фиг. 1. На фиг. 1 представлена схема молекулярно-генетической организации предлагаемого вектора для молекулярного клонирования . Предлагаемый вектор(4822 п.н.) содержит репликон плазмиды широкого круга хозяев 267 (-ген и -сайт) группы несовместимости Р-9, позволяющий им поддерживаться в бактериях(. , . , . , . ,. , . , . , . , . , . 2, . , . ), 1-репликон (1), обеспечивающий наследование в бактериях . , маркер канамицинрезистентности , полилинкерс единичными сайтами для клонирования,,, 651,,,, ,,,, расположенный непосредственно в -гене, что позволяет осуществлять встраивание чужеродных фрагментов ДНК, вызывая инактивацию гена, легко диагностируемое в клетках .по образованию неокрашенных колоний на селективной среде, содержащейи -, и могут эффективно вводиться в клетки бактерий .ипутем трансформации, электропорации или конъюгации с использованием мобилизующего штамма .19851, содержащего -гены плазмиды широкого круга хозяев 4 в составе бактериальной хромосомы. Пример 1. В качестве базовой конструкции, обеспечивающей наследование вектора в системе ., используют многокопийную плазмиду 18 (размером 3793 п.н.) 12, содержащую 1-репликон, маркер канамицинрезистентности , полилинкерс единичными сайтами для клонирования,,, 65 ,,,,,,,, расположенный непосредственно в -гене, что позволяет осуществлять встраивание чужеродных фрагментов ДНК, вызывая инактивацию гена, легко диагностируемое в клетках .по образованию неокрашенных колоний на селективной среде, содержащейи -, и могут эффективно вводиться в клетки бактерий .ипутем трансформации (электропорации) или конъюгации с использованием мобилизующего штамма .19851, содержащего -гены плазмиды широкого круга хозяев 4 в составе бактериальной хромосомы. В качестве -области, обеспечивающей наследование векторав бактериях, используют фрагмент плазмиды 267 13 размером 1088 п.н., содержащий -ген и -сайт инициации вегетативной репликации. В полимеразной цепной реакции с использованием набора(Япония) амплифицируют -область плазмиды 267 размером 1088 п.н. с помощью праймеров, содержащих на 5-концах сайты узнавания длярестриктазы, (5--3) и (5--3) при режиме амплификации 94 С - 5 мин (1 цикл) 94 С - 30 с,50 С - 30 с, 68 С - 1,5 мин (30 циклов) 68 С - 10 мин (1 цикл). Продукт амплификации встраивают в вектор, предназначенный для клонирования продуктов амплификации- . Встроенную последовательность ДНК вырезают из вектора -с помощью рестриктазыс последующей обработкой фрагментом Кленова и лигируют с вектором 18, предварительно обработанным сначала рестриктазой , а затем фрагментом Кленова. Рестриктазаузнает два сайта в векторе 18 в функционально незначимой области, обеспечивая образование делеции размером 59 п.н. Лигированной смесью трансформируют бактерии .КТ 2442, осуществляя отбор плазмидсодержащих бактерий на среде с канамицином. Из отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК 14, которой трансформируют бактерии .19851 15, содержащие -гены плазмиды широкого круга хозяев 4 в составе бактериальной хромосомы, из которых также выделяют плазмидную ДНК и на основании рестрикционного анализа отбирают искомую векторную конструкцию. Отобранную таким образом конструкцию называют вектор . Размер векторасоставляет 4822 п.н. В состав векторавходит 1-репликон, -область плазмиды 267, полилинкер размером 56 п.н., несущий 11 единичных сайтов для молекулярного клонирования, расположенный в -гене, что позволяет вести селекцию вставки на среде, содержащейи -, маркер устойчивости к канамицину, выражающийся в бактериях родаи . , и -сайт,позволяющий осуществлять конъюгационный перенос вектора с использованием мобилизующего штамма .19851, содержащего -гены плазмиды 4 в составе бакте 3 14736 1 2011.08.30 риальной хромосомы. Полученный вектор пригоден для молекулярного клонирования в клетках .и в бактериях рода . Емкость вектора более 8,0 т.п.н. Спектр хозяев .и бактерии рода(. , . , . , . , . , . , . , . , . , . , . , . ). Пример 2. При введении векторав клетки .путем трансформации частота возникновения трансформантов составляла 106 клеток на 1 мкг ДНК, а в бактерии рода(использовали метод электропорации 16) - от 103 до 107 клеток на 1 мкг ДНК. При введении векторав клетки бактерий родаметодом конъюгации частота переноса составила 7,710-2 для .2442, 9,210-2 для .2, 4,910-4 для .РМ 46, 5,710-6 для .4600, 1,110-4 для .В 972,1,410-2 для .975, 2,610-2 для .1246, 5,410-5 для.1295, 1,810-1 для .В 1296, 2,110-1 для .В 894, 1,510-2 для .1328, 1,610-2 для .14. Пример 3. Изучение стабильности наследования векторав неселективных условиях в клетках бактерий родасвидетельствует о том, что после 20 генераций в бактериальной популяции с концентрацией 109 клеток в миллилитре число плазмидсодержащих бактерий составляло для .КТ 2442 - 3,4108 кл/мл, для .2 2,5108 кл/мл, для .РМ 46 - 3,4106 кл/мл, для .972 - 3,1106 кл/мл, для .4600 - 5,2106 кл/мл, для .975 - 3,2105 кл/мл, для.В 1246 - 4,5107 кл/мл, для .1391 - 5,6108 кл/мл, для .ТВ - 8,3106 кл/мл, для .- 5,2106 кл/мл, для .В 1295 - 4,3106 кл/мл, для .В 1296 - 2,0106 кл/мл, для .894 2,0106 кл/мл, для .1328 - 7,4106 кл/мл, для .14 - 3,5108 кл/мл. Пример 4. Клонирование фрагмента хромосомной ДНК бактерий .-1 в клетках.и бактериях рода . Хромосомную ДНК бактерий штамма .-1, обработанную рестриктазой , лигировали с вектором , предварительно линеаризированным по сайту . Лигированной смесью трансформировали клетки.-1 . Селекцию вели на среде, содержащей -, , канамицин в конечной концентрации 25 мкг/мл. Полученные конструкции со вставками размером 3,8 т.п.н. и 8,3 т.п.н. сохраняли структурную стабильность при наследовании в клетках .и бактериях рода(проверено в штаммах .КТ 2442, .РМ 46,.4600, .1391, ., .В 1393). При этом частота мобилизации векторной конструкции, несущей вставки разного размера, соответствовала частоте мобилизации исходного вектора . Пример 5. Изменение стабильности наследования вектора . Обработка 0,8 раствором гидроксиламина плазмидной ДНК векторав течение 30 мин позволила отобрать варианты вектора, стабильность наследования которых составила 98-100(проверено в бактериях .ТВ, .КТ 2442, .РМ 46, .В 1295, .1391). Таким образом, получен челночный вектор для молекулярного клонирования фрагментов чужеродной ДНК размером более 8 т.п.н в бактериях родаи . ,позволяющий вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в клетках .. Введение векторной конструкцииможет осуществляться методом трансформации (электропорации) и конъюгации. 14736 1 2011.08.30 Источники информации 1.Р.Т... . - 1981. - . 439-448. 2... . - 1981. - . 16. - . 1-3. - . 237-247. 3... . . . - 1980. - . 178. - . 2. - . 375-380. 4.. . . - 1981. - . 145. - . 3. - . 1448-1451. 5.. / , , 1979. - . 411- 422. 6.. . - 1985. - . 14. - . 2. - . 118-125. 7. ЦЫГАНКОВ Ю.Д. и др. Генетика. - 1986. -11. - С. 2606-2619. 8... . . - 1994. - . 28. - . 1. - . 41-47. 9.. . . - 2006. - . 44. - . 6. - . 671-673. 10... . - 1994. - . 140. - . 1. - . 63-65. 11. . - 1987. - . 56. - . 2-3. - . 309-312. 12.. . . - 1994. - . 145. - . 69-73. 13. ЕСИКОВА Т.З. и др. Мол. Генет. Микробиол. Вирусол. - 1990. -4. - С. 25-28. 14.. . . . - 1979. - . 7. - . 6. - . 1513-23. 15. МАНИАТИС Т. и др. - М. Мир, 1984. - 480 с. 16... - 1995. - . 125-132. Сиквенс клонированного участка -области плазмиды 267 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 5

МПК / Метки

МПК: C12N 15/70, C12N 15/78

Метки: способ, молекулярного, бактериях, или, челночный, конструирования, вектор, escherichia, клонирования, рода, pseudomonas

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/5-14736-chelnochnyjj-vektor-dlya-molekulyarnogo-klonirovaniya-v-bakteriyah-roda-pseudomonas-ili-escherichia-coli-i-sposob-ego-konstruirovaniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях рода Pseudomonas или Escherichia coli и способ его конструирования</a>

Похожие патенты