Способ определения протеолитической активности желудочного сока

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ ВЕДОМСТВОРЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ(54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЖЕЛУДОЧНОГО СОКА О(71) Заявитель Гродненский государственный медицинский институт (ВЧ)(73) Патентообладатель Гродненский государ ственный медицинский институт (В)Способ определения протеолитической активности желудочного сока, включающий приготовлеъпте опытной пробы, смешивание ее с радиоактивным субстратом, инкубирование смеси с последующей остановкой реакции,Центрифугирование и определение радиоактивности супернатанта, отличающийся тем, что в качестве радиоактивного субстрата ИСПОЛЬЗУЮТ РНСТВОР ЭТИЛ-14 С-ГСМОГ лобина, опытную пробу смешивают с растворомэтил-НС-гемоглобина в объемном соотношенип 52, инкубирование смеси проводят в-течентте 14 - 16 минут при 0 С,а протеолитическую активность рассчитыч вают по формуле1400 - коэффициент пересчета активности на миллилитр сокаи 1 час. кИзобретение относится к области медицины и биохимии и может быть использовано в клиННК И ЭКСПЕРИМЕНТВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ Прстеолитической активности желудочного сока.Наиболее близким по совокупности признаков и получению требуемого технического результата (прототипом) к заявляемому изобретению является способ определения протеолитической активности желудочного сока 1, заключающийся в использовании радиоизотопного принципа индикации протеолиза. Для этого 1 мл субстрата (2,0 раствор моглобина в 0,12 н НС 1, содержащий 1 31 гемоглобин в концентрации 0,6 мкКи/ мл) смешивают с 1 мл разбавленного 0,1 М ацетатным буфером рН 5,3 желудочного сока, инкубируют 2 часа при 37,5 С. Результирующее значение рН составляет 2,3. Реакцию останавливают последователъиьш добавлением 0,1 мл 0,1 М бисульфита натрия и 1 мл 0,5 н трихлоруксусной кислоты. После центрифугирования радиоактивность одного миллилитра супернатанта определяют в счетчике радиоактивности. Данная величина пропорциональна активности (т.е. количеству) протеаз в исследуемом образце.протеолитическая активность желудочного сока является функцией нескольких переменныхВместе с тем, все методы определения данного параметра п уйго обязательно включают этап разведения желудочного сока буфером с фиксированным кислым рН, создавая таким образом искусственные оптимальные условия для определения активности пепсина, которая пропорциональна лишь количеству протеаз, активных при данной кислотности. Это приводит к существенной потере искомой информации - измеряется некая искусственная величина, не характеризующая агрессивных свойств сока. В некоторой степени это можно компенсировать умозрительно, сопоставляя активность пепсина с отдельно измеряемой кислотностью желудочного сока. Однако и такой подход не дает необходимой информации, т.к. при разведении сока теряется физиологическое соотношение различных компонентов и, С ЦРУ гой стороны, создаются неодинаковые по рН условия для работы различных изоформ протеаз. Частично это преодолевается проведением измерений при различных рН.Исследование 113 меченого субстрата является достоинством известного способа, позвляющим достичь высокой чувствительности. Однако более целесообразно было бы приме 10нить радиоактивный изотоп. испускающий менее жесткое излучение и обладающий большим периодом полураспада.Заявляемое изобретение направлено на решение задачи, заключающейся в повышении достоверности определения протеолитической активности желудочного сока. а также сокращении времени на проведение анализа.Поставленная задача решается тем, что в способе определения протеолитической активНОСТИ ЖЕЛУДОЧНОГО Сока, ВКГЮЧЗЮЩСМ ПРИГОтовление опытной пробы, смешивание ее с радиоактивным субстратом. инкубирование смеси с последующей остановкой реакции,центрифугирование и определение радиоактивности супернатанта, в качестве радиоактивного субстрата используют раствор этил-НС-гемоглобина опытную пробу смешивают с раствором этил -14 Сгемоглобшаа в объемном соотношении 5 2, инкубирование смеси проводят в течение 14 - 16 ькинут при ОС, а ПРОТСОЛИТИЧСКУЮ НКТИВНОСТЬ рассчитывают по формулеУР - удельная радиоактивность добавляемого субстрата, 67000 имп/мии/мт1400 - коэффициент пересчета активности на миллилитр сока и 1 час.Применение вместо 1131 (прототип) изотопа углерода С делает способ более безопасным,а также накладывает меньшие ограничения на сроки хранения радиоактивного субстрата. Для определения концентрации гемоглобина,обеспечивающей максимальную скорость реВКЦИИ, ПрОВЕДНО ИССЛДОБЗНИВ, РВЗУЛЬТВТЫ которого показывают, что оптимальная величина - 10-13 мг/мл (рис. 1).Увеличение либо уменьшение концентрацииГЕМОГЛОБИНЭ. ОТРИЦЗТСЛЬНО СКЗЗЫВЗВТСЯ на СКО рости реакции. Для выбора оптимального времени инкубации была изучена кинетика протеолиза при(рис. 2). Во всех случаях отмечался отрезок кривой, близкий к линейному на начальном участке. Однако он был весьма непродолжителен при 37 С (1 минута) и 20 С (4 минуты). И только при 0 С отрезок начальной скорости,близкий к линейному, отмечался на протяжении более 30 минут. Интервал времени 14 - 16 минут более удобен для регистрации,так как сокращение времени инкубации ведетопытных и контрольных проб, а при увеличе нии имеется дзероятность выхода за пределы линейного участка кривой приуизмеренииапроб с повышенной протеолитической активностью. На этом основании был выбран временной ин тервал- 16 минут при температуре 0 С.Дляпроведения-аналнзад был использован раствор гемоглобина с удельной радиоактивностьюб 7000 м-имп/ ьшн/ мг белка. Оптимальную концентрацию белка в пробе (10 - 13 мг/ мл) можнсддостичь, смешивая гемоглобине желудочным сокомдв соотношении 2 5. Это соотношение может быть изменено только в случае получения белка с другой удельной радиоактивностью. (Юъемреагентов (50 мкл-для сока и 20 мкл для субстрата) были выбраны, исходя из следующих соображений .-а). стремление миниатюриаировать -ана.ттиа, снижая таким образом расход реактивов и же лудочного сока б) сокранитьд достаточную у чувствительность способа, которая снижается при уменьшении обьемапробьь. 7 . Заявляемыйь способ иллюстрируется 2 графиками. Нарис. 1 изображена зависимостьскорасти реакции отконцентрации белка в пробе. На рис. 2 показана-. зависимость скорости реакции от температуры инкубационной среды Способ осуществляется следующиЬ/г образом. Желудочный сок получают. методом фракционного зондирования. Кисследуемой порции,охлажденной до ОС, прилипают водный раствор этил-НС-гетюглобииа в соотношении 5 2. Послединкъгбацшъв течение 14 и 16 минут при реакцшо останавливают добавлением равното объема 10 трихлоруксусной кислоты (ТХУ), .аатем пробу.центрифугируют при 12000.06 мин и супернатант отбирают для измерения. радиоактивности. Радиоактивность определяют 5 дв 5 диоксаиовом сцинтилляторе на счетчике Марк 2 (США).Протеолитическую активность рассчитывают по формулеРк - радиоактивность контрольной пробы ими/мин .УР - удельная радиоактивность добавляемого субстрата 67000 115111/ мин/ мг1400 -. коэффициент пересчета активности на мишшлитр. сок-а 111 час. цПример 1. Из порции желудочного сока,полученной при зондировании практическиЗдорового человека отбирают 50 мкл и поме щают в пластиковую пробирку однократногоприменения объемом -15 пордеддюю тмешают в ледяную баню для охлаждения на 10 - 15 минут. Реакцию начинают добавле ниемл 20 мклохлажденного до 0 Срй раствораэтил-НС темоглобина с концентрацией 35 ш/ььт и удельной активностью 67000 имп/мин/мг. По истечении 15 минут в пробирку пришивают 70 мкл 10 триклоруксусной кислоты. Для приготовления контрольной пробы меняюточередности добавления ТХУ и этил-Едс-гемоглобнна на обратную. Обе пробирки инку бируютуио льду 15 минут и центрифугирутот при 12000 об/мин в течение 3 минут. Отбрь рають по- 120 мкл- супернатанта и пришивают во флакон для счета радиоактивности, содержащий 10 мл диоксановою сцинтилляторагадиоактивность измеряют в течение одной минуты. протеолитическая активность в соот ветствии с вышеуказанной формулой равна- рольной пробы и все дальнейшие опера ции проводят, как описано в примере 1.20 мкл раствора етил-ЦС-гемоглобгша с кон центрациейг 45 мг/мл. Приготовлеьпдге контрольной пробы и все дальнейшие операции проводят, как описано в примере 1. Протеолитическая активность равнаПример 4. К 50 мкл- желудочного сока,полученного и приготовленного к анализу,как- описано в п 4 римере 1, добавляют 20 мкл рСТВФра этил-1 С-гемоглобинайс концентраЦией 540 мг/мли удельной активностью 670001 имп/мин/мг. По истечении 14 минут в пробирку приливают 70 мкл 10 ТХУ дляостановки реакции. Приготовление кон.трольной пробы и все дальнейшие операции проводят, как описано в примере 1. Протеолитическая активность в соответствии с приведенной вьште формулой равна цактивностью 67000 имп/ мин/ мг. По истечении 16 минут в пробирку приливают 70 мкл 10 ТХУ для остановки реакции. Приготовлениеконтрольной пробы и все дальнейшие опера ции проводят, как описано в примере 1. Протеолитическая активность равна ПА -1400 13,04 ш/мл/часПример 6. При зондировапии желудка больного Е, страдающего хр. гастритом со сниженной кислотообразующей функцией, получены базальная и стимулированные фракции. К 50 мкл желудочного сока каждой фракции приливают 20 мкл раствора гемоглобина с концентрацией 40 мг/ мл и удельной активностью 67000 имп/ мин/ час. Приготовление пробы и все дальнейшие манипуляции проводятся, как описано в примере 1. В соответствии с данными измерения радиоактивности Рк (базальн) 28 ими/мин Ро (базальнд г 32 ими/мин Рк (стимулирд 37 ими/мин Ро (стимулир.) 45 ими/мин. Отсюда протеолитическая активность равнаАналогичный анализ желудочного сока больною К, страдающего хроническим гастритом с сохраненной кислотообразующей функцией желудка, дал следующие результаты Ро, (базальн.) 3590 ими/мин Рк (базальнд 230 имп/ мин Ро (стимулирд 6572 ими/мин РкВ обеих фракциях желудочного сока больных Е и К измерена протеолитическая активность способом прототипа, а также рН, концентрация пепсина, пепсиногена общепринятыми методами. уДанные измерений сведены в таблицу. Как видно из таблицы, у больного Е со сниженной кислотообразующей функцией желудка (что подтверждается высокими значениями рН) нарушена кислотная активация пепсинагена в пенсии. Этот факт регистрируется как предлагаемым способом, так и способом прототипа. У больного К с сохраненной кислотообразующей функцией желудка процесс активации не нарушен, что подтверждают данные определения уровня протеаз и протеолитической активности.Однако при сравнении результатов, полученных предлагаемым ътетодом прототипа,заметно, чю поспешный дает более высокие значения. Особенно в случае больного Е. (в 60 - 100 раз у больного К - в 4 - 5 раз). Завышение данных в случае использования метода прототипа закономерно. Оно обусловлено общепринятым в энзимологии принцнлом использования искусственных оптимальных условий для определения активности фермента избыток субстрата, оптимальный ионный состав, рН. Такой подход, как видно из таблицы -, особенно чреват неточностями в случае снижения кислотообразующей функции желудка. Поскольку кислый буфер, используемый в способе прототипа, сам по себе стимулирует активность пепсина и даже активацию пепсиногена в ходе инкубации. Данные, полученные способом прототипа, отражают фактически уровень протеаз, активных в кислой среде (коррелируют с уровнем пепсина), а значения, полученные предлагаемым методом, реагируют также на рН и изоферментный спектр протеаз сока.Используя прототип и предлагаемый способ,изучена протеолитическая активность желудочного сока у больных хроническим гастритом. Электрофоретически в одном случае зарегистрирована нормальная концентрация пепсина в базальной и стщцшированнойфракцинк. В другом, со снижевнойкислотностью,пепсин практически отсутствовал, хотя секреция пепсиногена была сохранена (табл. ). Результаты измерения протеолитической активности предложенным методом полностью совпали с данными электрофореза и измерения рН (табл) Уровень протеолитической активности, полученный с помощью прототипа, существенно отличается количественно и качественно (табл.). Более высокая скорость протеолиза в случае прототипа объясняется тем, что измерения проводятся в условиях,оптимальных для функционирования протеаз,но не отражающих реальную ситуацию йп уйуо. Еще более существенное завышение результатов получено в случае хронического гастрита со сниженной кислотообразующей функцией. Это обусловлено тем, что в ходе инкубации в кислой среде из пепсиногена образуется пепсин, который в оптимальных условиях дает ложную активность.Таким образом, предлагаемый способ обеспечивает по сравнению с прототипом сокращение срока инкубации в 8 раз, тем самым уменьшая длительность определения, и более высокую достоверность получаемых результатов, отражающих реальную протеолитическую активность желудочного сока.

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/34, G01N 33/60

Метки: протеолитической, определения, сока, желудочного, способ, активности

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/5-1047-sposob-opredeleniya-proteoliticheskojj-aktivnosti-zheludochnogo-soka.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ определения протеолитической активности желудочного сока</a>

Похожие патенты