Способ очистки поликлональных иммуноглобулинов класса G из сыворотки крови и устройство для аффинной хроматографии

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПАТЕНТНЫЙ КОМИТЕТ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ СПОСОБ ОЧИСТКИ ПОЛИКЛОНАЛЬНЫХ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ КЛАССАИЗ СЫВОРОТКИ КРОВИ И УСТРОЙСТВО ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ(71) Заявитель Витебский медицинский университет(73) Патентообладатель Витебский медицинский университет(57) 1. Способ очистки поликлональных иммуноглобулинов классаиз сыворотки крови, включающий осаждение иммуноглобулинов 0,75 раствором риванола в соотношении 12, преципитацию выделенных иммуноглобулинов сульфатом аммония раствором 33-40 насыщения с последующим диализом против 0,9 раствора , отличающийся тем, что после осаждения иммуноглобулинов дополнительно проводят аффинную хроматографию на агарозе, коньюгированной с протеином А золотистого стафилококка, причем остатки риванола удаляют при хроматографии или до нее. 2. Устройство для аффинной хроматографии, включающее колонку с матрицей, отличающееся тем, что оно дополнительно содержит резервуар для элюента, соединенного с колонкой посредством промежуточного сосуда и разъемных креплений. 3205 1 Изобретение относится к медицине, в частности к клинической иммунологии и инфекционным болезням,а также к биохимии и может быть использовано для выделения из сыворотки крови иммуноглобулинов классадля дальнейшего исследования и изучения, а также для приготовления препаратов каталитических антител, люминесцирующих антител, других коньюгатов, например, для проведения иммуноферментного анализа (ИФА). В последнем случае освобождение от основного количества балластных белков (главным образом от альбумина) позволяет снизить неспецифические реакции, вызываемые коньюгатом. Чаще используют комбинированный способ очистки поликлональных иммуноглобулинов риванолсульфатным методом 1. Он обеспечивает удаление альбумина, а также а- и -глобулинов.с соавт. показали, что риванол, оставшийся после первого переосаждения, удаляется на сефадексе -25. Основной недостаток данного метода связан с потерей иммуноглобулинов при очистке, значительная часть которых остается в растворе после преципитации сульфатом аммония. Следует отметить, что теоретически вместе с иммуноглобулинами преципитируют и другие белковые соединения, имеющие сходный молекулярный вес. Все это ограничивает его практическое применение. Задачей изобретения является разработка способа для выделения из сыворотки крови поликлональных(1, 2 и 4) без примесей других белковых молекул иммуноглобулиновой и неиммуноглобулиновой природы. В качестве прототипа предлагаемого изобретения принят существующий способ очистки поликлональных иммуноглобулинов (риванол-сульфатный метод). Сущность предложения заключается в выделении поликлональных ИГ путем первого переосаждения риванолом с последующей аффинной хроматографией на агарозе, коньюгированной с протеином А золотистого стафилококка, удаления остатка риванола, элюции поликлональныхс последующим осаждением сульфатом аммония. Удаление остатка риванола производится путем адсорбции его на активированном угле или отмывкой непосредственно на агарозе. Способ осуществляется следующим образом Негепаринизированную человеческую кровь центрифугируют 30 минут в центрифужных пробирках в центрифуге с бакетным ротором при 4,5(1500 об/мин). К надосадочной жидкости добавляют 0,75 риванола в соотношении 12. Смесь инкубируют при температуре 37 С 1 час и центрифугируют 30 минут. Полученную в итоге надосадочную жидкость пропускают под давлением через колонку, содержащую активированный уголь, уравновешенную 0,01-0,1 М фосфатным буфером рН 7,4, а затем аккуратно вводят в колонку, содержащую агарозу, коньюгированную с протеином А золотистого стафилококка и уравновешенную 0,1 М фосфатным буферным раствором (ФБР) рН 7,4. Аффинную хроматографию проводят, пропуская надосадок через колонку со скоростью 6-7 капель/мин. Колонку последовательно промывают 0,1 М ФБР рН 7,4 с 1 раствором тритона Х-305 в количестве, равном 4-5 объмам колонки, и 0,01-0,1 М фосфатным буферным раствором рН 7,4 в количестве, равном 16-20 объемам колонки. Элюцию проводят 0,1 М глицин-НС 1 буфером рН 2,8 до исчезновения белка в пробе (объем одной фракции 1,5-2,0 мл). Колонку затем промывают 0,1 М ФБР с 1 раствором тритона Х-305, равным 20-25 объемам колонки до рН 7,4. Полученные элюаты объединяют и добавляют сульфат аммония до 40 насыщения. Инкубируют при комнатной температуре 15 минут. Преципитирующиеся иммуноглобулины осаждают в центрифуге с угловым ротором при 32,3(6000 об/мин) в течение 15 минут. Надосадочную жидкость сливают. Осадок диализуют против 0,9. Модификация способа отличается тем, что остатки риванола удаляют во время аффинной хроматографии непосредственно на агарозе, коньюгированной с протеином А золотистого стафилококка, при промывании колонки 0,01-0,1 М фосфатным буферным раствором рН 7,4 в количестве, равном 30-60 объемам колонки, до исчезновения желтого окрашивания. Для сравнения существующих методов очистки ИГ и разработанного способа исследовали 3 способа очистки поликлональных иммуноглобулинов 1) риванол-сульфатный метод (рив. сульф.) 2) метод аффинной хроматографии (аф. хром.) 3) комбинацию риванол-сульфатного способа и аффинной хроматографии, предлагаемую нами (рив.аф.хр.). Оценивали качественный, количественный состав и степень чистоты поликлональных ИГ после очистки разработанным нами методом и двумя другими способами. Концентрациюопределяли спектрофотометрически по поглощению на 280 нм, при этом использовали коэффициент пересчета 1,45. Классы иммуноглобулинов идентифицировали в радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. Степень очистки иммуноглобулинов определяли с помощью следующих методов анализа электрофореза по ГрабаруУильямс, иммуноэлектрофореза с последующей окраской серебром 2, диск-электрофореза в диссоциирующем полиакриламидном геле с последующей окраской Кумасси 250, капиллярного иммуноблоттинга с проявлением полос бензидином. 3205 1 Результаты различных методов очистки поликлональных иммуноглобулинов представлены в таблицах(таб. 1, таб. 2). Таблица 1 Процент выхода белка после очистки поликлональныхНаименование метода Рив. сульф. Аф. хром. Рив.-аф.хр. Качественный состав выделенных(иммунодиффузия по Оухтерлони) Наименование метода Рив. сульф. Аф. хром. Рив.-аф.хр. В образцах ИГ, полученных методами риванол-аффинной хроматографии, риванол-сульфатным и методом аффинной хроматографии, иммуноглобулины после электрофоретического разделения сформировали одну сплошную полосу, соответствующую . При очистке только методом аффинной хроматографии в образцах присутствовали и примеси неиммуноглобулиновых молекул, которые в двух других вышеперечисленных методиках не обнаруживались. При очистке ИГ с помощью комбинации ионообменной хроматографии на ДЕАЕ- 650 с риванол-сульфатным методом обнаруживалось небольшое количество примесей неиммуноглобулиновых молекул, комбинация же ДЕАЕ-очистки и аффинной хроматографии приводила к тем же результатам, что и риванол-аффинно-хроматографический метод. Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что предложенный нами метод по чистоте получаемых препаратов ИГ является наиболее оптимальным, требует меньших финансовых затрат и пригоден для получения препаратов каталитических антител, а также для приготовления препаратов люминесцирующих антител и других коньюгатов. Эффективность способа заключается в том, что он позволяет обеспечить высокий выходи дает возможность получить препараты иммуноглобулинов класса(1, 2 ,4) без примесей . Устройство для аффинной хроматографии. Существующие устройства для аффинной хроматографии с крупнопористыми матрицами (агароза, сефароза) представляют собой стеклянный или полимерный цилиндрический сосуд или трубку различного диаметра и длины с суженным выходным отверстием, где находится мелкопористая мембрана. Устройство располагается вертикально. К нижнему выходному отверстию присоединяется трубка для отвода жидкости. Колонка заполняется гранулами матрицы и проводится соответствующая хроматография путем тока жидкости сверху вниз под действием силы тяжести. Данные устройства имеют определенные недостатки. Они связаны с неудобством введения в колонку большого количества элюента с ограничением объма вводимой жидкой фазы из-за невозможности изменить длину и объем колонки. Кроме того, при одномоментной загрузке в колонку большого объема элюента значительно увеличивается давление на матрицу, что может привести к деформации последней, а следовательно к ухудшению условий хроматографии. Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является, например, устройство для хроматографии фирмы 2 и т.п., представляющее собой полимерные цилиндрические сосуды, располагающиеся вертикально, с узким выходным отверстием, где находится мелкопористая мембрана, на которую наслаивают гранулы матрицы. К нижнему выходному отверстию присоединяется трубка для отвода жидкости. Задачей изобретения является усовершенствование устройства для аффинной хроматографии. Сущность предложения заключается в создании нового варианта колонки для аффинной хроматографии путем применения разъемных креплений, приводящих к быстрому разъединению прибора для очистки и обработки последнего, а также использования промежуточного цилиндра (уменьшающего давление на матрицу) и резервуара для элюента. Цилиндр и резервуар могут иметь различный объем и диаметр, что позволяет изменять объем, длину и давление в колонке. Схема и работа прибора. Предлагаемое устройство для аффинной хроматографии низкого давления состоит из трех цилиндрических сегментов различного диаметра, соединнных между собой переходной и соединительной трубками, и эластического шланга с зажимом (фиг. 1). Предлагаемое нами устройство состоит из двух цилиндрических сегментов (1 и 2) диаметром 14 мм и длиной 63 мм. В первом сегменте располагают мембрану-фильтр (5) и агарозу, коньюгированную с протеином А золотистого стафилококка. К нижнему концу первого сегмента, че 3 3205 1 рез переходную трубку диаметром 7 мм и длиной 20 мм (7), присоединяют эластический шланг с зажимом(6) диаметром 5 мм. К верхнему концу данного сегмента, через соединительную трубку (4) диаметром 12 мм и длиной 25 мм, присоединяют второй сегмент. Верхний конец второго промежуточного сегмента соединен через переходную трубку (7) с нижним концом третьего сегмента (3) диаметром 23 мм и длиной 85 мм. Работа устройства. Нижний сегмент заполняют агарозой, коньюгированной с протеином А золотистого стафилококка, которую наслаивают на мембрану-фильтр, находящийся в нижней части сегмента. Объем колонки достигает 5 мл и более в случае применения цилиндров большего диаметра. Второй сегмент присоединяют к первому с помощью резиновой или силиконовой переходной трубки после наслаивания жидкости на верхний слой агарозы. Третий сегмент с помощью силиконовой соединительной трубки соединяют с вторым сегментом (узкая часть прибора). Верхний сегмент наполняется жидкостью, которую затем постепенно вводят во второй сегмент с помощью осторожного сжатия последнего. Второй сегмент заполняется частично (не более чем на 1/4). Объем второго сегмента - 5 мл, а третьего - 20 мл и более. Максимальный объем исходной жидкости,вводимой в колонку, составляет 25 мл и более, в случае применения цилиндров большего диаметра. Вся система быстро разбирается на отдельные части, которые легко обработать и химически простерилизовать. Аффинную хроматографию проводят, пропуская надосадок через колонку со скоростью 6-7 капель/мин. В третий сегмент прибора постепенно добавляют остальной объем жидкости, необходимый для очистки. Колонку укрепляют вертикально на штативе с помощью зажимов. Данное устройство в результате применения разъемных креплений и цилиндров различного диаметра и объма дает возможность разъединять прибор для очистки и обработки последнего, а также увеличивать длину и объм колонки, снижая при этом давление на матрицу, в результате использования воздушной прослойки в промежуточном цилиндре. Государственный патентный комитет Республики Беларусь. 220072, г. Минск, проспект Ф. Скорины, 66.

МПК / Метки

МПК: G01N 33/48

Метки: очистки, поликлональных, аффинной, способ, устройство, крови, сыворотки, иммуноглобулинов, класса, хроматографии

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/4-3205-sposob-ochistki-poliklonalnyh-immunoglobulinov-klassa-g-iz-syvorotki-krovi-i-ustrojjstvo-dlya-affinnojj-hromatografii.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ очистки поликлональных иммуноглобулинов класса G из сыворотки крови и устройство для аффинной хроматографии</a>

Похожие патенты