Способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов

Номер патента: 16957

Опубликовано: 30.04.2013

Авторы: Никандров Виталий Николаевич, Пыжова Нелли Семеновна

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОЦЕНКИ ФИБРИНОГЕНЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ(71) Заявитель Учреждение образования Полесский государственный университет Национального банка Республики Беларусь(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна(73) Патентообладатель Учреждение образования Полесский государственный университет Национального банка Республики Беларусь(56) НИКАНДРОВ В.Н. и др. Роль антропогенных и природных патогенов в формировании инфекционных и неинфекционных болезней человека. Медико-биологические аспекты проблемы Материалы Международной конференции. - Минск НЕССИ, 2002. - С. 326-342.1472508 1, 1989.1390241 1, 1988. Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов. Методы исследования. Ленинград Наука, 1979. - С. 24-28.(57) Способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что на фибриноген-агаровую пластину, приготовленную с использованием 0,05 боратного буфера 11,0, в который добавлен агар до концентрации 1 , однозамещенный фосфат натрия или калия до концентрации (0,15-10,0)10-2 и фибриноген человека в количестве 20 г на 1 л буфера, наносят 15 мкл суспензии клеток условно-патогенных микроорганизмов, инкубируют при 37 С в течение 24 часов и оценивают фибриногенлитическую активность условно-патогенных микроорганизмов по площади зоны лизиса фибриногена. Изобретение относится к медицине и биологии, в частности к оценке щелочной протеолитической активности, т.е. активности протеиназ с оптимумом 9,0 и выше, клеток условно-патогенных микроорганизмов. В настоящее время определение протеолитической активности условно-патогенных микроорганизмов затруднено, поскольку используемые для такого анализа белковые субстраты - казеин, гемоглобин, желатин, альбумин, фибрин 1, 2 - в обычных условиях часто не расщепляются протеиназами микроорганизмов. Между тем оценка расщепления этих субстратов чрезвычайно важна для общебиологических исследований биохимической дифференциации видов и штаммов, например рода 3, рода 4 и др., а также для прикладных целей создания или изыскания прежде всего специфических ингибиторов протеиназ, учитывая важную роль этих энзимов в жизнедеятельности патогенных микроорганизмов и патогенезе ряда заболеваний бактериальной этиологии. Известен способ определения протеолитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что образцы суспензии клеток в 0,15 растворе 16957 1 2013.04.30 наносят на белок-агаровые пластины, содержащие в качестве субстрата гемоглобин или казеин в концентрации 10 г/л, агар Дифко, а также 0,15 раствор 7,4, инкубируют пластины при 37 С в течение 24 часов, обрабатывают их 2 н трихлоруксусной кислоты и учитывают протеолитическую активность по степени расщепления белка субстрата, измеряя площадь зон лизиса белка, обусловленного действием на субстрат активных протеолитических энзимов 5. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является добавление исследуемых образцов к белковому субстрату (белок-агаровой пластине), инкубация при температуре 37 С и определение меры расщепления белкового субстрата. Однако недостатком прототипа является низкая чувствительность способа, что часто не позволяет вообще выявить наличие щелочной протеолитической активности в исследуемом образце. Задачей заявляемого способа является повышение чувствительности способа выявления щелочной протеолитической активности условно-патогенных микроорганизмов. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов, заключающийся в том, что на фибриноген-агаровую пластину, приготовленную с использованием 0,05 боратного буфера 11,0, в который добавлен агар до концентрации 1 , однозамещенный фосфат натрия или калия до концентрации (0,15-10,0)10-2 М и фибриноген человека в концентрации 20 г на 1 л буфера, наносят 15 мкл суспензии клеток условно-патогенных микроорганизмов, инкубируют при 37 С в течение 24 часов и оценивают фибриногенлитическую активность условно-патогенных микроорганизмов по площади зоны лизиса фибриногена. Использование при приготовлении белок-агаровой пластины в качестве белка-субстрата фибриногена и 0,05 боратного буфера 11,0, в который добавляют однозамещенный фосфат натрия (или калия) в концентрации (0,15-10,0)10-2 М, позволяет значительно повысить чувствительность способа определения щелочной протеолитической активности клеток условно-патогенных микроорганизмов. Пример 1 Готовят 8 пластин 1 -ного агарана 0,05 М боратном буфере 11,0, содержащих фибриноген человека в концентрации 2 . Пластину 1 готовят с использованием в качестве растворителя 0,05 боратного буфера 11,0 без добавок (контроль). Остальные пластины готовят с использованием в качестве растворителя 0,05 боратного буфера 11,0 с добавлением однозамещенного фосфата натрия в концентрации (10-2 ) пластину 2 - 10,0 пластину 3 - 5,0 пластину 4 - 2,5 пластину 5 - 1,25 пластину 6 - 0,63 пластину 7 - 0,31 пластину 8 - 0,15. На все пластины наносят по 15 мкл микродозатором суспензий клеток, выделенных при центрифугировании из суточных бульонных культур 10 различных штаммов условно-патогенных микроорагнизмов. Затем инкубируют все фибриноген-агаровые пластины с нанесенными на поверхность образцами при 37 С в течение 24 часов. Затем обрабатывают пластину 2 н раствором трихлоруксусной кислоты и измеряют площадь зон расщепления фибриногена в мм 2. Результаты определения площади зон расщепления фибриногена представлены в табл. 1. Из данных табл. 1 видно, что определение активности щелочных протеиназ клеток условно патогенных микроорганизмов достигается только в присутствии в реакционной системе однозамещенного фосфата натрия в концентрации (0,63-10,0)10-2 . Пример 2. Готовят 8 пластин 1 -ного агарана 0,05 боратном буфере 11,0, содержащих фибриноген человека в концентрации 2 . Пластину 1 готовят с использованием в качестве растворителя 0,05 боратного буфера 11,0 без добавок (контроль). Остальные пластины готовят с использованием в качестве растворителя 0,05 боратного буфера 11,0 с добавлением однозамещенного 2 16957 1 2013.04.30 фосфата калия в концентрации (10-2 ) пластину 2 - 10,0 пластину 3 - 5,0 пластину 4 - 2,5 пластину 5 - 1,25 пластину 6 - 0,63 пластину 7 - 0,31 пластину 8 0,15. На все пластины наносят по 15 мкл микродозатором суспензий клеток, выделенных при центрифугировании из суточных бульонных культур 10 различных штаммов условнопатогенных микроорганизмов. Затем инкубируют все фибриноген-агаровые пластины с нанесенными на поверхность образцами при 37 С в течение 24 часов. Затем обрабатывают пластину 2 н раствором трихлоруксусной кислоты и измеряют площадь зон расщепления фибриногена в мм 2. Результаты определения площади зон расщепления фибриногена представлены в табл. 2. Таблица 1 Влияние однозамещенного фосфата натрия на щелочную фибриногенлитическую активность (мм 2 площади зон лизиса) клеток различных условно-патогенных микроорганизмов. Растворитель при приготовлении геля - 0,05 боратный буфер 11,0 (представлены средние значения,4) Микроорганизм Таблица 2 Влияние однозамещенного фосфата калия на щелочную фибриногенлитическую активность (мм 2 площади зон лизиса) клеток различных условно-патогенных микроорганизмов. Растворитель при приготовлении геля - 0,05 боратный буфер 11,0 (представлены средние значения,4) Микроорганизм 0 92 110 127 90 0 0 0 0 68 106 88 107 0 0 0 Из данных таблицы видно, что определение активности щелочных протеиназ клеток условно - патогенных микроорганизмов достигается только в присутствии в реакционной системе однозамещенного фосфата калия в концентрации (0,15-10,0)10-2 М. 3 16957 1 2013.04.30 Источники информации 1. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта и др. 9-е изд. - М. Мир, 1997. Т. 1. - С. 237. 2. Определитель бактерий Берджи / Под ред. Дж. Хоулта и др. 9-е изд. - М. Мир, 1997. Т. 2. - С. 603. 3. Методы определения протеолитической активности и выделения протеолитических ферментов. В кн. Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов (методы исследования). - Л. Наука, 1979. - С. 24-33. 4. Билай Т.П. Термофильные грибы и их ферментативные свойства. - Киев Науковая думка, 1985. - С. 55-76. 5. Никандров В.П., Пыжова Н.С., Шатило НЛ. Протеолитическая и эндонуклеазная активность штаммовпри росте на питательных средах сложного состава. . Нейтральные деполимеразы // Роль антропогенных и природных патогенов в формировании инфекционных и неинфекционных болезней человека. Медико-экологич. аспекты проблемы Матер. междунар. конфер. - Минск, 2002. - С. 326-342. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/02, G01N 33/50

Метки: активности, условно-патогенных, микроорганизмов, фибриногенлитической, способ, оценки

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/4-16957-sposob-ocenki-fibrinogenliticheskojj-aktivnosti-uslovno-patogennyh-mikroorganizmov.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ оценки фибриногенлитической активности условно-патогенных микроорганизмов</a>

Похожие патенты