Способ определения концентрации ДНК Trichomonas vaginalis в биологическом материале

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ДНКВ БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(72) Авторы Костюк Светлана Андреевна Кулага Ольга Константиновна Бадыгина Наталья Александровна Полуян Ольга Сергеевна Руденкова Татьяна Владимировна(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования(56) Клиника, диагностика и лечение хронического урогенитального трихомониаза у женщин. Методические рекомендации. - Минск БелМАПО, 2008. С. 23-25.2348695 2, 2009.2005/031005 А 2. КОСТЮК С.А. и др. Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус. Серыя медыцынскх навук. - 2006. -5. С. 74-76. КУЛАГА О.К. и др. Медицинские новости. - 2008. -5. - С. 76-78.(57) Способ определения концентрации ДНКв биологическом материале, заключающийся в том, что выделяют ДНК из биологического материала, проводят с ней полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с использованием праймеров 53 и 53 и олигонуклеотидной флуоресцентно меченой пробы 53,определяют значение цикла амплификации , при котором флуоресценция превысит пороговый уровень, и рассчитывают концентрацию ДНК 1, выраженную в количестве копий на 1 мл биологического материала, по формуле 110(-0,4429,552). Изобретение относится к области медицины, к разделу клинической лабораторной диагностики. Известен способ определения концентрациив исследуемом клиническом материале на основании культивированияна питательных средах 1. Аналогов, близких к заявляемому изобретению, прототипа не обнаружено. Недостатками данного способа являются жесткие требования к транспортировке биологического материала, необходимость длительного периода культивирования. 15868 1 2012.06.30 Применение метода ПЦР в режиме реального времени позволяет проводить быстрое определение концентрации ДНКс высокими показателями чувствительности и специфичности. Задачей заявленного способа является определение в короткие сроки концентрации ДНК возбудителя в биологическом материале. Поставленная задача решается следующим образом. Предложен способ определения концентрации ДНКв биологическом материале, заключающийся в том, что выделяют ДНК из биологического материала, проводят с ней полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени с использованием праймеров 53,53 иолигонуклеотидной меченой пробы 53,определяют значение цикла амплификации СТ, при котором флуоресценция превысит пороговый уровень, и рассчитывают концентрацию ДНК 1, выраженную в количестве копий на 1 мл биологического материла, по формуле 110(-0,4429,552). Пример. Необходимо определить концентрацию ДНКв 1 мл биологического материала пациента А. На первом этапе из 100 мкл биологического материала пациента выделяют ДНК сорбционным методом. При этом к 100 мкл физиологического раствора, содержащего клинический материал в пробирке объемом 1,5 мл (типа ), добавляют 300 мкл раствора(лизирующего, 6 М раствор гуанидина изотиоцианата) и 10 мкл суспензии сорбента (2). Пробы инкубируют в течение 10 мин при комнатной температуре, 1-2 раза перемешивая на микроцентрифуге Вортекс -1500 (Хеликон, Россия) при 1500 об/мин. Пробы центрифугируют в течение 15 с на центрифуге Циклотепм-201( 4,8, встряхивают и центрифугируют. Процедуру отмывки повторяют 2 раза с использованием раствора(промывочного, 70 этанол). Пробирки помещают в твердотельный микротермостат (модель 205, СТМ, Россия) и подсушивают пробы 5 мин при температуре 50 С, оставляя пробирки открытыми. В пробирки с осадком добавляют 50 мклбуфера (на 1 л буфера 0,04 М Трис-ацетат (242 г Трис, 57,1 мл ледяной уксусной кислоты), 0,002 М ЭДТА (100 мл 0,5 М ЭДТА 8,0) и инкубируют в течение 5 мин при 50 С. Пробирки центрифугируют в течение 15 с при 12 тыс. оборотов. Водную фазу используют в качестве исследуемого образца ДНК для постановки реакции амплификации. На втором этапе осуществляют амплификацию ДНК, выделенной из биологического материала, и образцов калибратора ДНК, которые необходимы для определения концентрации ДНКпри проведении ПЦР в режиме реального времени. Используемые образцы калибратора ДНКсодержат известные концентрации ДНКв диапазоне от 102 до 105 копий/мл. Проводят подготовку пробирок с ПЦР-смесью-1, в которых под слоем воска содержатся смесь специфических праймеров, позволяющих детектировать специфический фрагмент ДНК, и нуклеотиды. Размораживают пробирку с ПЦР-смесью-3, которая содержитолигонуклеотидные меченые пробы, комплементарные специфическому фрагменту ДНК, и тщательно перемешивают содержимое. Праймеры для детекциии последовательностиолигонуклеотидных меченых проб были выбраны из однокопийного гена( 2 15868 1 2012.06.30)с использованиемпрограммного обеспечения. 53-, 53,олигонуклеотидная меченая проба метитсяв качестве флуорофора по 5 - концу и в качестве гасителя по 3 концу 53. Готовят верхнюю ПЦР-смесь из расчета 7 мкл ПЦР-смеси-2 (буфер и полимераза) и 3 мкл ПЦР-смеси-3 на одну реакцию. В пробирки с ПЦР-смесью-1 на поверхность застывшего воска раскапывают по 10 мкл верхней ПЦР-смеси, которая не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦРсмесью-1. В подготовленные таким образом пробирки вносят образцы ДНК по следующей схеме пробирка 1 - 10 мкл ДНК, выделенной из биологического материла пациента А пробирка 2 - 10 мкл калибратора ДНКс концентрацией 102 копий/мл пробирка 3 - 10 мкл калибратора ДНКс концентрацией 2 10 копий/мл пробирка 4 - 10 мкл калибратора ДНКс концентрацией 3 10 копий/мл пробирка 5 - 10 мкл калибратора ДНКс концентрацией 3 10 копий/мл пробирка 6 - 10 мкл калибратора ДНКс концентрацией 4 10 копий/мл пробирка 7 - 10 мкл калибратора ДНКс концентрацией 104 копий/мл пробирка 8 - 10 мкл калибратора ДНКс концентрацией 105 копий/мл пробирка 9 - 10 мкл калибратора ДНКс концентрацией 105 копий/мл пробирка 10 - 10 мкл отрицательного контрольного образца. Помещают пробирки в ячейки ротора термоциклера 6000 ( , Австралия). Задают следующую программу для одновременной амплификации ДНК 95 С - 10 мин 50 циклов 95 С - 10 с, 60 С - 35 с, 72 С - 15 с. Этап амплификации при проведении полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (реал-тайм ПЦР) с использованиемолигонуклеотидных меченых проб основан на использовании 5-экзонуклеазной активности полимеразы. В реакционную смесь добавляют ДНК-пробы, меченные на 5-конце флуоресцентным красителем, а на 3-конце - фосфатной группой и гасителем флуоресценции. Пробы комплементарны участку амплифицируемой области. Гаситель поглощает испускаемое флуоресцентной меткой излучение, а фосфатная группа в 3-положении блокирует полимеразу. При отжиге праймеров олигонуклеотидная меченая проба количественно связывается с комплементарным участком ДНК. Во время стадии элонгации полимераза синтезирует комплементарную цепь ДНК и, дойдя до участка, гибридизованного с пробой, начинает расщеплять пробу за счет 5-экзонуклеазной активности. В результате флуоресцентная метка отделяется от гасителя, и ее свечение может детектироваться. Увеличение флуоресценции прямо пропорционально количеству наработанного ПЦР-продукта. Кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходной концентрацией матрицы, что дает возможность точно оценить концентрацию ДНК в биологическом материале. Цикл , при котором флуоресценция превышает пороговый уровень, задаваемый автоматически, используют для расчета концентрации ДНК. 3 15868 1 2012.06.30 Итоговое уравнение, характеризующее взаимосвязь порогового цикла флуоресценции и количества амплифицированной ДНК, а именно 110(-0,4429,552),используется для расчета концентраций ДНКв 1 мл биологического материла. При определении концентрации ДНКметодом количественной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени с использованием смесиолигонуклеотидных меченых проб и смеси праймеров для проведения у данного пациента значение порогового цикла 18,85, поэтому 110(-0,44218,859,552)16,61. В биологическом материале данного пациента обнаружена концентрация ДНК, равная 16,61 копий/мл, что позволяет судить об активности и выраженности инфекционного процесса и необходимости назначения соответствующего протокола лечения. Таким образом, заявляемый способ позволяет получить следующие преимущества возможность определения концентрациив биологическом материале в течение 1 дня, мониторинг ПЦР-активности в реальном времени, исключение риска контаминации, сокращение трудоемкости исследования. Источники информации 1. Клиника, диагностика и лечение хронического урогенитального трихомониаза у женщин. Методические рекомендации. - Минск БелМАПО, 2008. - С. 23-25. 2.2348695 2, 2009. 3.2005/031005 2. 4. КОСТЮК С.А. и др. Весц Нацыянальнай акадэм навук Беларус Серыя медыцынскх навук. - 2006. -5. - С. 74-76. 5. КУЛАГА О.К. и др. Медицинские новости. - 2008. -5. - С. 76-78. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4

МПК / Метки

МПК: G01N 33/48, C12Q 1/68, C12R 1/90

Метки: способ, определения, vaginalis, днк, концентрации, материале, trichomonas, биологическом

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/4-15868-sposob-opredeleniya-koncentracii-dnk-trichomonas-vaginalis-v-biologicheskom-materiale.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ определения концентрации ДНК Trichomonas vaginalis в биологическом материале</a>

Похожие патенты