Способ количественного определения разных видов микроорганизмов в биологическом материале

Номер патента: 12583

Опубликовано: 30.10.2009

Авторы: Дорошкевич Олег Николаевич, Улащик Владимир Сергеевич

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗНЫХ ВИДОВ МИКРООРГАНИЗМОВ В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Улащик Владимир Сергеевич Дорошкевич Олег Николаевич(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт физиологии Национальной академии наук Беларуси(57) 1. Способ количественного определения разных видов микроорганизмов в биологическом материале, отличающийся тем, что биологический материал инкубируют с магнитоуправляемыми наночастицами, содержащими иммобилизованные на них поликлональные антитела ко всем определяемым видам микроорганизмов, собирают магнитоуправляемые наночастицы с помощью магнитного сепаратора и инкубируют с индикаторными наночастицами, каждая из которых содержит иммобилизованные на ней моноклональные антитела к одному определяемому виду микроорганизма и соответствующий фермент в качестве маркера, затем, используя магнитное удерживание, отделяют промыванием образовавшиеся комплексы магнитоуправляемых и индикаторных частиц и определяют количественно микроорганизмы разных видов по интенсивности цветной реакции, катализируемой соответствующим ферментом. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют фермент, выбранный из гидролазы, трансферазы, лиазы, изомеразы, лигазы, синтетазы и оксидоредуктазы. Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии, инфекционным болезням и лабораторной диагностике. Известен способ, описанный в патенте США, сущность которого состоит в том, что образец биологического материала инкубирует, по крайней мере, с двумя различными моноклональными антителами или другими специфическими узнающими химическими структурами, которые реагируют с эпитопами двух антигенов одного и того же возбудителя, с последующей детекцией прореагировавших узнающих структур 1. Указанный способ является аналогом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и аналога является использование узнающих структур и их последующей детекции. Однако способ не позволяет одновременно определять присутствие сразу нескольких микроорганизмов в одной пробе биологического материала. 12583 1 2009.10.30 Известен способ гетерогенного иммуноанализа, описанный в патенте США и основанный на образовании специфического иммунного комплекса с множественными компонентами, несущими конъюгаты антигена. Способ обеспечивает оптимизацию формата для определения антител как с низкой, так и с высокой аффинностью, а также обеспечивает количественное определение как антител, так и антигена, присутствующих в образце. При этом в качестве маркеров могут, в частности, использоваться ферменты, фрагменты ферментов и другие компоненты ферментативных систем 2. Указанный способ является аналогом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является использование узнающих структур и их последующей детекции. Способ также не позволяет одновременно определять присутствие нескольких микроорганизмов в одной пробе биологического материала. Известен способ иммунохимического выявления инфекционных агентов в биологическом материале, описанный в патенте РФ 3. Способ состоит в иммуномагнитной сорбции инфекционных агентов из относительно большого объема биологического материала и концентрирования сорбированных агентов с помощью специального постоянного магнита на поверхности предметного стекла для микроскопии. Далее предметное стекло с нанесенными бактериями обрабатывают флюоресцентно-мечеными антителами к инфекционному агенту и производят подсчет бактерий с использованием люминесцентного микроскопа. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является количественное определение одного вида микроорганизмов в одной пробе заключающееся во взаимодействии компонентов микроорганизмов со специфическими рецепторами, иммобилизованными на поверхности наночастиц, отделении образовавшихся комплексов компонентов пробы и последующей детекции количества образовавшихся комплексов. Однако способ-прототип также не позволяет в одной пробе биологического материала одновременно выявлять несколько видов микроорганизмов, что существенно снижает его диагностическую ценность. Задачей заявляемого способа является повышение чувствительности и скорости одновременного анализа всех микробиологических компонентов образца. Поставленная задача достигается следующим образом. Предложен способ количественного определения разных видов микроорганизмов в биологическом материале, когда биологический материал инкубируют с магнитоуправляемыми наночастицами, содержащими иммобилизованные на них поликлональные антитела ко всем определяемым видам микроорганизмов, собирают магнитоуправляемые наночастицы с помощью магнитного сепаратора и инкубируют с индикаторными наночастицами, каждая из которых содержит иммобилизованные на ней моноклональные антитела к одному определяемому виду микроорганизма и соответствующий фермент в качестве маркера, затем, используя магнитное удерживание, отделяют промыванием образовавшиеся комплексы магнитоуправляемых и индикаторных частиц и определяют микроорганизмы разных видов по интенсивности цветной реакции, катализируемой соответствующим ферментом. При этом используют фермент, выбранный из гидролазы, трансферазы, лиазы, изомеразы, лигазы, синтетазы и оксидоредуктазы. Отличительной особенностью заявляемого способа является одновременная сверхчувствительная детекция единичных возбудителей разных видов в отдельной пробе биологического материала. Детекция основана на определении интенсивности цветной реакции,катализируемой ферментами, т.е. на взаимодействии находящихся в биологическом образце микроорганизмов или их компонентов со специфическими рецепторами ко всем определяемым в данном анализе микроорганизмам (бактерия, спора, риккетсия, вирус и т.п.), компонентам их структур или специфическим продуктам жизнедеятельности организма в ответ на инфекцию. При этом специфические рецепторы химически закреплены 2 12583 1 2009.10.30 на поверхности магнитоуправлямых частиц и немагнитных индикаторных частиц. Причем на магнитоуправляемых частицах закреплены все виды узнающих структур, а на каждом виде немагнитных индикаторных частиц закреплены только по одному типу узнающих структур одновременно с одним видом индикатора. Индикатор представляет собой один из компонентов ферментативной системы, приводящий к образованию окрашенного или флюоресцирующего продукта. В качестве маркеров могут использоваться ферменты,фрагменты ферментов, ингибиторы ферментов и другие компоненты ферментативных систем. Когда любой из этих компонентов используют в качестве метки, то химическая реакция, включающая один из этих компонентов, является частью системы генерации сигнала. Наиболее предпочтительны ферменты, которые обеспечивают образование перекиси водорода и ее использование для одновременного окисления бесцветного соединения в окрашенное. Когда используют ферменты, то молекулярная масса метки обычно варьирует от 10 кД до 600 кД, а используемые реакции в основном гидролитические или окислительно-восстановительные. Иммобилизованные катализаторы могут включать фермент с неферментным катализатором. Фермент образует промежуточное соединение, которое подвергается реакции, катализируемой неферментным катализатором, либо неферментный катализатор образует промежуточное соединение (включающее коферменты), которое катализирует фермент. Используемый фермент или кофермент обеспечивает желаемое увеличение сигнала путем образования продукта, который поглощает свет, например краситель, или излучает свет при облучении, например флюорофор. Как вариант каталитическая реакция может вести к прямому излучению света, т.е. хемилюминесценции. К таким ферментам относятся сахаридо-оксидазы (глюкозаоксидаза и галактозаоксидаза) или оксидазы гетероциклических соединений (уриказа или ксантиноксидаза) в комбинации с ферментом, который использует перекись водорода для окисления бесцветного предшественника в краситель (пероксидазы из сои, из хрена, лактопероксидаза). Другими ферментами, которые могут быть использованы в качестве маркера, являются гидролазы,трансферазы, лиазы, изомеразы, лигазы или синтетазы и оксидоредуктазы. Для генерации хемилюминесцентного сигнала используют люциферазу светлячков или бактериальную люциферазу. Среди дегидрогеназ предпочтительнее использовать малатдегидрогеназу,глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и лактатдегидрогеназу. Среди оксидаз предпочтительнее использовать глюкозоксидазу, а среди пероксидаз - пероксидазу хрена. Среди гидролаз наиболее используют щелочную фосфатазу, бетаглюкозидазу и лизоцим. Также могут быть использованы ферменты, которые в качестве кофактора содержат никотинамид аденин-динуклеотид (НАД) или его фосфат (НАДФ). Среди них отметим НАД-зависимую глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу. Для анализа одновременно многих видов возбудителей инфекции в одной биологической пробе необходимы несколько типов немагнитных наночастиц с определенным индикаторным ферментом,присоединенным к поверхности частиц совместно со специфическим рецептором (антиген, антитело, нуклеотидный зонд, аптамер и т.п.) к возбудителям определяемых инфекций или компонентам их структур, или специфическим продуктам жизнедеятельности организма в ответ на инфекцию магнитоуправляемые наночастицы со специфическими рецепторами ко всем видам возбудителей, определяемым в данном анализе магнитный манипулятор для перемещения магнитных частиц в реакционные сосуды детектирующее устройство, позволяющее определить интенсивность цветных реакций, катализируемых ферментами на индикаторных наночастицах. Пример количественное определение . в образцах проводят с использованием стандартных 96-луночных планшетов (НУНК) и 8 канального магнитного манипулятора. Аликвоты взвеси . в 0,05 М НФБ с 0,01 Твин-20 с определенным количеством 3 12583 1 2009.10.30 бактериальных тел инкубируют 30 мин при постоянном встряхивании с аликвотами по 20 мг магнитоуправляемых и немагнитных флуоресцентных, маркированных пероксидазой наночастиц. В контроле микробных тел не добавляют. Общий объем смеси составляет 400 мкл. Затем осуществляется предварительное концентрирование микробных тел с помощью магнитоуправляемых частиц. Для этого разводят в 5 мл 0,05 М НФБ с 0,01 Твин-20 взвесь микробных тел . в концентрации 103 микробных тел в мл и добавляют к этому объему 50 мг магнитоуправляемых наночастиц. Затем проводят инкубацию при температуре 15-20 С и постоянном встряхивании в течение 30 минут. После этого все магнитные наночастицы собирают с помощью магнитного сепаратора М-10. Затем эти частицы переносят в лунку стандартного 96-луночного планшета, добавляют к ним 20 мг немагнитных флуоресцентных, маркированных пероксидазой наночастиц и инкубируют в объеме 400 мкл. Используя магнитное удерживание с помощью 8 канального магнитного манипулятора, трижды промывают образовавшиеся комплексы бактериальных тел, магнитоуправляемых и немагнитных маркированных наночастиц и отделяют их от не связанных с комплексами маркированных наночастиц. Затем к отмытым комплексам добавляют субстратную смесь для определения активности пероксидазы (1 объем 5 мМ 3,3, 5,5-тетраметиленбензидина в 70 диметилсульфоксиде и 3 объема 3 мМ Н 2 О 2 в 0,15 М цитратфосфатном буфере,4,0) и инкубируют 20 минут при температуре 15-20 С. Используя магнитное удерживание, с помощью 8 канального магнитного манипулятора отбирают окрашенный раствор и переносят в чистые лунки стандартного 96-луночного планшета. Ферментативную реакцию останавливают 4,824. Оптическую плотность измеряют при 450 нм в планшетном спектрофотометре . По типу реакции судят о присутствии соответствующего возбудителя, а по интенсивности окраски - о количестве частиц возбудителя. Таким образом, достигаемый технический результат заявляемого способа заключается в том, что в одной пробе биологического материала можно определить весь необходимый для исследования состав микроорганизмов в течение 2-х часов, что позволяет использовать данный способ в качестве экспресс-метода. Предельная чувствительность способа составляет 104 микобактерий на пробу. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4

МПК / Метки

МПК: G01N 33/50, G01N 33/52

Метки: разных, способ, количественного, материале, определения, микроорганизмов, биологическом, видов

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/4-12583-sposob-kolichestvennogo-opredeleniya-raznyh-vidov-mikroorganizmov-v-biologicheskom-materiale.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ количественного определения разных видов микроорганизмов в биологическом материале</a>

Похожие патенты