Челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях рода Pseudomonas и Escherichia coli и способ его конструирования

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ(54) ЧЕЛНОЧНЫЙ ВЕКТОР ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОГО КЛОНИРОВАНИЯ(71) Заявитель Белорусский государственный университет(72) Авторы Ковальчук Константин Валентинович Василенко Светлана Леонидовна Титок Марина Алексеевна(73) Патентообладатель Белорусский государственный университет(57) 1. Челночный вектор рКМ размером 3690 п.н. для молекулярного клонирования в бактериях родаи, содержащий репликон -ген и -сайт плазмиды 267 группы несовместимости Р-9, 1-репликон плазмиды 1, маркер канамицинрезистентностии полилинкер с единичными сайтами для клонирования,,, 136 ,,, 65 ,,,,,,, , расположенный в -гене, позволяющий осуществлять встраивание чужеродного фрагмента ДНК размером 8000 п.н., вызывая инактивацию -гена. 2. Способ конструирования челночного вектора рКМ по п. 1, заключающийся в том,что ДНК плазмиды К 18 гидролизуют рестриктазой , обрабатывают фрагментом Кленова и соединяют ДНК-лигазой с амплифицированной в полимеразной цепной реакции последовательностью репликона плазмиды 267, обработанной фрагментом Кленова. 12277 1 2009.08.30 Предлагаемое техническое решение относится к химии, в частности к генной инженерии, и может быть использовано в биотехнологии для клонирования чужеродных молекул ДНК в системе грамотрицательных бактерий рода- Е. . Для молекулярного клонирования в бактериях родасоздано два типа челночных векторов. Все они способны поддерживаться в бактериях Е.(за счет областей плазмид 322, 19, 15, 7 или рМ 16) и отличаются типом репликона, обеспечивающего наследование в клетках 1-10. Первый тип векторов создан на основе плазмиды 1010 группы несовместимости Р-4 1-7. Несмотря на присутствие репликона широкого круга хозяев, некоторые из них не способны передаваться и наследоваться в клетках бактерий 4-6. Кроме того, все они характеризуются большими размерами (от 11,6 до 16,9 т.п.н.), что осложняет работу с ними при постановке экспериментов, особенно со встроенными фрагментами чужеродной ДНК значительного размера. Для введения данного типа векторов в клетки бактерийв основном применялся метод конъюгации с использованием мобилизующей плазмиды группы несовместимости -1, которая передается совместно с векторными молекулами в клетки реципиентов и затрудняет дальнейший анализ трансконъюгантного потомства. Недостатком всех векторов данного типа является принцип отбора вставок чужеродных фрагментов ДНК, основанный на инактивации маркеров антибиотикорезистентности. Многие сайты, пригодные для клонирования, не могут быть использованы, поскольку не обеспечивают получение конструкций с искомым фенотипом. Второй тип челночных векторов создан на основе репликонов узкого круга хозяев 8-10. Основным недостатком этих векторных систем является способность их наследоваться только в одном виде псевдомонад. Например, вектор 1 размером 4,87 т.п.н., содержащий -область плазмиды 1614, имеет удобную систему отбора вставок (инактивация-гена), но способен наследоваться только в бактериях . , в клетки которых может вводиться путем трансформации или электропорации (не содержит -сайта) 9. Задачей изобретения является создание челночного вектора для молекулярного клонирования в бактериях родаи Е. , позволяющего клонировать в указанных организмах фрагменты чужеродной ДНК, размером более 8 т.п.н., и содержащего систему, позволяющую вести прямую селекцию вставок чужеродных молекул ДНК в клетках Е. . Технический результат состоит в конструировании челночного вектора, содержащего 1-репликон, обеспечивающий наследование в бактериях Е. , и -область плазмиды широкого круга хозяев 267 группы несовместимости Р-9, обеспечивающей поддержание в клетках бактерий рода . Поставленная задача решается тем, что с помощью генно-инженерных манипуляций конструируют вектор для молекулярного клонирования, способный эффективно вводиться и поддерживаться в бактериях родаи Е. . Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается тем,что в функционально незначимую область вектора рК 18 была осуществлена вставка области плазмиды 267 группы несовместимости Р-9, обеспечивающая поддержание векторной молекулы в широком круге бактерий рода . Сущность изобретения поясняется на фигуре. На фигуре представлена схема молекулярно-генетической организации предлагаемого вектора для молекулярного клонирования рКМ. Предлагаемый вектор - вектор рКМ размером 3690 п.н. для молекулярного клонирования в бактериях родаи, содержащий репликон плазмиды 267(-ген и -сайт) группы несовместимости Р-9, 1-репликон (1), маркер канамицинрезистентностии полилинкер с единичными сайтами для клонирования,,, 136 ,,, 65 ,,,, Ас ,,, ), расположенный в -гене, позволяющий осуществлять встраивание чужеродных фрагментов ДНК размером более 8 000 п.н., вызывая инактивацию -гена. 2 12277 1 2009.08.30 Пример 1 В качестве базовой конструкции, обеспечивающей наследование вектора в системе Е. , используют многокопийную плазмиду рК 18 (размером 2661 п.н.) 11, содержащую 1-репликон, маркер канамицинрезистентности , полилинкерс единичными сайтами для клонирования,,, 136 ,,, 65 , ,,,,,,, расположенный непосредственно в-гене, что позволяет осуществлять встраивание чужеродных фрагментов ДНК, вызывая инактивацию -гена, и может эффективно вводиться в клетки бактерий Е.ипутем трансформации (электропорации). В качестве -области, обеспечивающей наследование вектора рКМ в бактериях , используют фрагмент плазмиды 267 13 размером 1088 п.н., содержащий-ген и -сайт инициации вегетативной репликации. В полимеразной цепной реакции с использованием набора(Япония) амплифицируют -область плазмиды 267 размером 1088 п.н. с помощью праймеров, содержащих на 5-концах сайты узнавания длярестриктазы, (5--3) и (5--3) при режиме амплификации 94 С - 5 мин (1 цикл) 94 С - 30 сек,50 С - 30 сек, 68 С - 1,5 мин (30 циклов) 68 С - 10 мин (1 цикл). Продукт амплификации встраивают в вектор, предназначенный для клонирования продуктов амплификации - . Встроенную последовательность ДНК вырезают из векторас помощью рестриктазыс последующей обработкой фрагментом Кленова и лигируют с вектором р 18, предварительно обработанный сначала рестриктазой, а затем фрагментом Кленова. Рестриктазаузнает два сайта в векторе р 18 в функционально незначимой области, обеспечивая образование делеции размером 59 п.н. Лигированной смесью трансформируют бактерии .2442, осуществляя отбор плазмидосодержащих бактерий на среде с канамицином. Из отобранных клонов выделяют плазмидную ДНК 14, которой трансформируют бактерии Е.-115. Отобранную таким образом конструкцию называют вектор рКМ. Размер вектора рКМ составляет 3690 п.н. В состав вектора рКМ входит 1-репликон, -область плазмиды 267, маркер устойчивости к канамицину, полилинкер с 14 единичными сайтами, расположенный в -гене, позволяющий осуществлять встраивание чужеродных фрагментов ДНК, вызывая инактивацию -гена. Полученный вектор пригоден для молекулярного клонирования в клетках Е.и в бактериях рода . Емкость вектора составляет более 8,0 т.п.н. Спектр хозяев Е.и бактерии рода(. , . , . , . , . , . ,. , . , . , . , . , . ). Пример 2 При введении вектора рКМ в клетки Е.путем трансформации частота возникновения трансформантов составляла 106 клеток на 1 мкг ДНК, а в бактерии рода(использовали метод электропорации 16) - от 103 до 107 клеток на 1 мкг ДНК. Пример 3 Клонирование фрагмента хромосомной ДНК бактерий Е.-1 в клетках Е.и бактериях рода . Хромосомную ДНК бактерий штамма Е.-1, обработанную рестриктазой, лигировали с вектором рКМ, предварительно линеаризированным по сайту. Лигированной смесью трансформировали клетки Е.-1 . Селекцию вели на среде, содержащей -, , канамицин в конечной концентрации 25 мкг/мл. Полученные конструкции со вставками размером 3,8 т.п.н. и более 8 т.п.н. сохраняли структурную стабильность при наследовании в клетках Е.и бактериях рода(проверено в штаммах .2442, .46,.4600, .В 1391, .ТВ, .В 1393). При этом частота трансформации векторной конструкции, несущей вставки разного размера,соответствовала таковой исходного вектора рКМ. 3 Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 4

МПК / Метки

МПК: C12N 15/64

Метки: молекулярного, способ, вектор, escherichia, рода, клонирования, конструирования, pseudomonas, бактериях, челночный

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/4-12277-chelnochnyjj-vektor-dlya-molekulyarnogo-klonirovaniya-v-bakteriyah-roda-pseudomonas-i-escherichia-coli-i-sposob-ego-konstruirovaniya.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Челночный вектор для молекулярного клонирования в бактериях рода Pseudomonas и Escherichia coli и способ его конструирования</a>

Похожие патенты