Конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 24R-метилбрассиностероидов

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК (2006) НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ КОНЪЮГАТ 24-ЭПИКАСТАСТЕРОНА С ПЕРОКСИДАЗОЙ ХРЕНА В КАЧЕСТВЕ МЕЧЕНОГО АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ 24-МЕТИЛБРАССИНОСТЕРОИДОВ(71) Заявитель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси(72) Авторы Хрипач Владимир Александрович Свиридов Олег Васильевич Литвиновская Раиса Павловна Прядко Андрей Георгиевич Драч Светлана Васильевна Матвеенцев Виталий Демидович Новик Татьяна Валентиновна(73) Патентообладатель Государственное научное учреждение Институт биоорганической химии Национальной академии наук Беларуси где ПХ - пероксидаза хрена,в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 24-метилбрассиностероидов. Изобретение относится к области иммунохимического анализа фитогормонов брассиностероидов, а именно к конъюгату 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена формулы где ПХ - пероксидаза хрена,который может быть использован в качестве меченого антигена в аналитической тестсистеме для иммуноферментного определения 24-метилбрассиностероидов - 24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида. Брассиностероиды - природные низкомолекулярные биорегуляторы, которые являются гормонами растений 1. Они присутствуют во всех растительных объектах и обладают ростмодулирующим и адаптогенным действием. Содержание брассиностероидов в растениях очень низко - 10-5-10-9 и менее. В очень малых концентрациях они проявляют и свое биологическое действие. В настоящее время неизвестны конъюгаты брассиностероидов с пероксидазой хрена(или другой иммуноферментной меткой), которые были получены и могли бы быть использованы в иммуноаналитических системах для определения 24-эпикастастерона и эпибрассинолида. Целью изобретения является ранее неизвестный конъюгат 24-эпикастастерона и пероксидазы хрена, который может быть использован в качестве меченого антигена в иммуноферментном анализе 24-метилбрассиностероидов - 24-эпикастастерона и 24-эпибрассинолида. Поставленная цель достигается заявляемым конъюгатом , который получают взаимодействием 6-О-карбоксиметоксиламиноксима 24-эпикастастерона через -оксисукцинимидный эфир с пероксидазой хрена в водной среде в присутствии гидрокарбоната калия(рН 8,5), очисткой на сефадексе и замораживанием раствора в глицерине. Сущность изобретения подтверждается примерами конкретного выполнения. Пример 1 Растворяют 0,11 г (0,21 ммоль) (22,23,24)-2,3,22,23-тетрагидрокси-24-метил 5-холест-6-илиденаминооксиуксусной кислоты и 0,019 г (0,165 ммоль) -оксисукцинимида в 2 мл абсолютного диоксана, охлаждают до 5 и при перемешивании добавляют раствор 0,029 г (0,14 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в 0,5 мл абсолютного диоксана. Реакционную смесь перемешивают 30 мин при 5 и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую в осадок дициклогексилкарбомочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают. Остаток растворяют в этилацетате, промывают водой, сушат безводным 24, упаривают. Выход -сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон 0,105 г (92 ). Маслообразный продукт, спектр 10,66 (с, 3 Н, 18-), 0,74 (с, 3 Н,19-), 0,8-1,00 (, 12, 21-, 26-, 27- и 28-), 2,88 (с, 4 Н, 2-2), 3,063,24 (, 2), 3,28-3,38 (, 2), 3,78 (, 1), 3,92-4,00 (, 1), 4,88 (, 2 Н, -О-СН 2-СО). ИК-спектр (пленка) 3440, 2950, 2880, 1755, 1730, 1725, 1390, 1215, 1090. К раствору 6 мг пероксидазы хрена в 600 мл дистиллированной воды в присутствии 2-3 капель 0,1 М раствора гидрокарбоната натрия (рН 8,35) добавляют раствор 2 мг(0,003 ммоль) -сукцинимидного эфира 6-О-КМО-эпикастастерон-, перемешивают при комнатной температуре в течение 1,5 ч. Очищают на колонке с сефадексом, элюент 2 9771 1 2007.10.30 дистиллированная вода. Собирают окрашенную фракцию (желто-коричневая), затем разбавляют глицерином (12) и хранят в морозильнике (при -18 ). Синтезированный конъюгат используют в качестве меченого антигена в иммуноаналитической системе для количественного определения 24-метилбрассиностероидов (24 эпибрассинолида и 24-эпикастастерона), что подтверждается примером конкретного выполнения. Пример 2 Для проведения анализа в лунки планшета с иммобилизованными антителами вносят по 50 мкл калибровочных проб или исследуемых растворов брассиностероидов и 100 мкл рабочего раствора конъюгата 24-эпикастастеронпероксидаза хрена. Планшеты инкубируют в течение 2 ч при 37 без встряхивания, затем удаляют жидкость из лунок и промывают их 1 раствором , содержащим 0,0220. Для проведения цветной реакции в лунки немедленно вносят по 150 мкл раствора 3,3, 5,5-тетраметилбензидина в субстратном буфере и инкубируют планшет в течение 15 мин при 37 без доступа света. Реакцию останавливают добавлением в каждую лунку по 50 мкл стоп-реагента и не позже чем через 30 мин проводят измерение оптической плотности на ИФА-ридере при длине волны 450 нм. Результаты анализа рассчитывают методом интерполяции по калибровочной кривой 2. Концентрация нативного антигена, при которой достигается замещение половины меченого антигена в комплексе антитело-антиген, составила 7 нмоль/л в случае 24-эпикастастерона и 11 нмоль/л в случае 24-эпибрассинолида. Заявляемый конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена получается с высоким выходом, обладает стабильностью, обеспечивает необходимую иммуногенность метки и позволяет проводить количественное определение 24-эпибрассинолида и 24-эпикастастерона методом иммуноферментного анализа. Источники информации 1. Хрипач В.А., Лахвич Ф.А., Жабинский В.Н. Брассиностероиды. - Минск Навукатэхнка, 1993. - 288 с. 2. Егоров Теория и практика иммуноферментного анализа. - . Высш. шк.,1991. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3

МПК / Метки

МПК: C07J 41/00

Метки: 24-эпикастастерона, конъюгат, 24r-метилбрассиностероидов, меченого, качестве, пероксидазой, антигена, хрена, определения, иммуноферментного

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/3-9771-konyugat-24-epikastasterona-s-peroksidazojj-hrena-v-kachestve-mechenogo-antigena-dlya-immunofermentnogo-opredeleniya-24r-metilbrassinosteroidov.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Конъюгат 24-эпикастастерона с пероксидазой хрена в качестве меченого антигена для иммуноферментного определения 24R-метилбрассиностероидов</a>

Похожие патенты