Способ определения карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КАРБОНИЛПРОИЗВОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ БЕЛКОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр гигиены(72) Авторы Ткачев Сергей Викторович Соболь Юрий Александрович Филонов Валерий Петрович(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр гигиены(57) Способ определения карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови, заключающийся в том, что белки сыворотки крови окисляют в течение 1 ч в среде, приготовленной на 0,01/0,15 буфере с 7,4, содержащей 4,аскорбиновую кислоту и 22 в конечных концентрациях 10 мкМ, 2 мМ и 100 мМ соответственно, к пробе окисленной сыворотки добавляют равный объем 0,1 раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч при постоянном встряхивании, осаждают белки сыворотки крови 20 раствором трихлоруксусной кислоты, пробу центрифугируют при 3000 в течение 20 мин, полученный осадок промывают 1 раз дистиллированной водой и 3 раза смесью этанола и этилацетата, взятых в соотношении 11, высушивают и растворяют в 6 растворе гуанидингидрохлорида, измеряют оптическую плотность раствора образовавшихся динитрофенилгидразонов на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 370 нм, используя в качестве контроля сыворотку крови, не подвергнутую окислению, и определяют содержание карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови с использованием молярного коэффициента светопоглощения, равного 21103 -1 см-1. Изобретение относится к биохимии, в данном случае к разделам биохимии белка, а также к разделу клинической лабораторной диагностики. Известен способ определения карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови, заключающийся в реакции взаимодействия карбонильных групп окисленных ами 16937 1 2013.04.30 нокислотных остатков белков сыворотки крови с 2,4-динитрофенилгидразином с образованием окрашенных динитрофенилгидразонов аминокислот 1. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является использование в определении карбонилпроизводных аминокислот 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ). Недостатком данного способа является то, что в нем используются неоправданно высокие концентрации 2,4-ДНФГ (2 раствор 2,4-ДНФГ в 2 ), также прототип обладает более низкой специфичностью и воспроизводимостью по отношению к заявляемому способу. Задачей заявляемого изобретения является повышение специфичности и воспроизводимости за счет проведения дополнительных процедур очистки окрашенного продукта, а также изменения последовательности операций (реакцию с 2,4-ДНФГ проводят до процедуры осаждения белка трихлоруксусной кислотой (ТХУ и экономичности - за счет использования более низких концентраций 2,4-ДНФГ. Поставленная задача достигается следующим образом предложен способ определения карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови, заключающийся в том, что белки сыворотки крови окисляют в течение 1 ч в среде, приготовленной на 0,01/0,15 буфере с 7,4, содержащей 4, аскорбиновую кислоту и 22 в конечных концентрациях 10 мкМ, 2 мМ и 100 мМ соответственно, к пробе окисленной сыворотки добавляют равный объем 0,1 раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 и инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч при постоянном встряхивании, осаждают белки сыворотки крови 20 раствором трихлоруксусной кислоты, пробу центрифугируют при 3000 в течение 20 мин, полученный осадок промывают 1 раз дистиллированной водой и 3 раза смесью этанола и этилацетата, взятых в соотношении 11,высушивают и растворяют в 6 растворе гуанидингидрохлорида, измеряют оптическую плотность раствора образовавшихся динитрофенилгидразонов на спектрофотометре СФ 46 при длине волны 370 нм, используя в качестве контроля сыворотку крови, не подвергнутую окислению, и определяют содержание карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови с использованием молярного коэффициента светопоглощения, равного 21103 -1 см-1. Пример 1. Исследования выполняют на 10 нелинейных белых крысах с исходной массой 160180 г. Крыс декапитируют под эфирным наркозом. Собирают вытекавшую из шейных сосудов кровь. Сыворотку крови отделяют от форменных элементов путем центрифугирования (3000 об/мин). Окисление белков сыворотки крови проводят в течение 1 ч, в среде,содержащей 10 мкМ 4 В среду инкубации также входят аскорбиновая кислота (АК) и 22 соответственно в конечных концентрациях 2 и 100 мМ. Растворы реагентов готовят на 0,01 М /0,15 буфере ( - 7,4). После процедуры окисления к 1,0 мл сыворотки приливают 1,0 мл 0,1 раствора 2,4-ДНФГ в 2. Инкубацию осуществляют при комнатной температуре в течение 1 ч при постоянном встряхивании образца, затем пробы центрифугируют при 3000 в течение 20 мин. Осадок промывают 1 раз дистиллированной водой для удаления водорастворимых карбонилсодержащих соединений, прореагировавших с 2,4-ДНФГ, и 3 раза смесью этанолэтилацетат (11) для экстракции липидов и 2,4-ДНФГ, который не прореагировал с карбонильными группами окисленных аминокислот. Полученный осадок высушивается для удаления растворителей и затем растворяется в 6 М гуанидингидрохлориде. Оптическую плотность образовавшихся динитрофенилгидразонов регистрируют на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 370 нм. Содержание карбонилпроизводных аминокислот определяют с использованием молярного коэффициента светопоглощения, равного 21 мМ-1 см-1. В качестве контроля используют сыворотку крови, которую не подвергали окислению. В таблице приведены результаты оценки содержания динитрофенилгидразонов в нативной и окисленной сыворотке крови крыс способом-прототипом и заявляемым способом. 2 16937 1 2013.04.30 Содержание карбонилпроизводных аминокислот в нативной (1) и окисленной (2) сыворотки крови крыс, мкмоль ДНФГ/мл сыворотки Способ-прототип Заявляемый способ(критерий Стьюдента) Как видно из данных таблицы, снижение концентрации 2,4-ДНФГ и дополнительная процедура отмывки осадка дистиллированной водой приводят к некоторому снижению уровня значений динитрофенилгидразонов белков в нативной и окисленной сыворотке крови, вероятно, за счет удаления низкомолекулярных водорастворимых соединений небелкового происхождения, прореагировавших с 2,4-ДНФГ. Также обнаружено, что заявляемый способ обладает более низкой вариабельностью по сравнению с прототипом. Таким образом, достигаемый технический результат заявленного способа, по сравнению с прототипом, заключается в повышении специфичности и воспроизводимости метода, а также его удешевлении. Способ может использоваться в научных и клинических диагностических лабораториях для оценки окислительной модификаций белка, в том числе и при патологических состояниях. Способ прост, не требует значительных финансовых затрат на его осуществление и позволяет повысить точность и качество исследований, что, в свою очередь, позволяет решать вопросы точной диагностики процессов, сопровождаемых окислительными процессами. Источники информации 1. Дубинина Е.Е., Бумистров С.О., Ходов Д.А., Поротов Г.Е. Вопросы медицинской химии. - 1995. -1. - С. 24-26. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3

МПК / Метки

МПК: G01N 33/49, G01N 21/27

Метки: аминокислот, сыворотки, белков, определения, карбонилпроизводных, крови, способ

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/3-16937-sposob-opredeleniya-karbonilproizvodnyh-aminokislot-belkov-syvorotki-krovi.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ определения карбонилпроизводных аминокислот белков сыворотки крови</a>

Похожие патенты