Способ ингибирования фибриногенолитической и казеинолитической активности внутриклеточных протеиназ токсигенного штамма Corynebacterium diphtheriae PW-8

Номер патента: 14796

Опубликовано: 30.10.2011

Авторы: Никандров Виталий Николаевич, Пыжова Нелли Семеновна

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

(51) МПК НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОЙ СОБСТВЕННОСТИ СПОСОБ ИНГИБИРОВАНИЯ ФИБРИНОГЕНОЛИТИЧЕСКОЙ И КАЗЕИНОЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ПРОТЕИНАЗ ТОКСИГЕННОГО ШТАММА-8(71) Заявитель Государственное учреждение Республиканский научнопрактический центр эпидемиологии и микробиологии(72) Авторы Никандров Виталий Николаевич Пыжова Нелли Семеновна(73) Патентообладатель Государственное учреждение Республиканский научно-практический центр эпидемиологии и микробиологии(56) НИКАНДРОВ В.Н. и др. Доклады Национальной академии наук Беларуси. - 2007. - Т. 51. -3. - С. 92-97.2182598 2, 2002.6031087 , 2000. ПЫЖОВА Н.С. и др. Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии. Материалы международной конференции. Минск, 2004. - С.100-102. НИКАНДРОВ В.Н. и др. Проблемы инфекционной патологиивека. Материалы юбилейной конференции,посвященной 80-летию НИИЭМ. Минск, 2004. - С. 177-191. Никандров В.Н. и др. Современные проблемы инфекционной патологии человека (вирусология, микробиология, иммунология, эпидемиология и клиника). Материалынаучнопрактической конференции. - Минск,2001. - С. 318-338.(57) Способ ингибирования фибриногенолитической и казеинолитической активности внутриклеточных протеиназ в разрушенных путем замораживания-оттаивания или обработкой ультразвуком клетках токсикогенного штамма-8, отличающийся тем, что к разрушенным клеткам добавляют гидрохинон до концентрации 10-3-10-2 М. Изобретение относится к экспериментальной медицине и биологии, в частности к ингибированию активности внутриклеточных протеиназ токсигенного штамма коринебактерии дифтерии. Для целей медицинской биотехнологии и разработки рациональной химиотерапии дифтерии громадное значение имеет раскрытие путей направленной регуляции токсиногенеза. Из источников научной литературы известно, что в оптимальных для токсиногенеза условиях производственный высокотоксигенный штамм -8 проявляет активность внутриклеточных протеиназ, свойства которых, судя по ингибиторному анализу, резко отличаются от протеиназ, образующихся в нетоксигенных штаммах этого микроорганизма либо в неоптимальных для токсиногенеза условиях 1, 2. 14796 1 2011.10.30 Это создает возможности для использования данной особенности организации внутриклеточного метаболизма токсигенных штаммов для направленной регуляции токсиногенеза в целях биотехнологии и перспективы разработки химиотерапевтических средств нового поколения при дифтерийной инфекции. Известен способ ингибирования активности внутриклеточных протеиназ токсигенного штамма коринебактерии дифтерии путем добавления к взвеси разрушенных (многократным замораживанием-оттаиванием либо ультразвуковой дезинтеграцией) клеток бульонной культуры коринебактерии дифтерии штамм -8 раствора нитротетразолиевого синего в концентрации 10-3 М с последующим определением протеолитической активности по лизису фибриногена (или казеина) в тонком слое агарового геля 2. При этом достигается полное (100 ) ингибирование активности внутриклеточных протеиназ токсигенного штамма. Указанный способ является прототипом по отношению к заявляемому. Общим признаком для заявляемого способа и прототипа является ингибирование протеолитической активности разрушенных клеток бульонной культуры коринебактерии дифтерии при добавлении к взвеси этих клеток химического соединения. Однако применяемый для ингибирования протеолитической активности внутриклеточных протеиназ токсигенного штамма нитротетразолиевый синий в равной степени ингибирует и активность внутриклеточных протеиназ нетоксигенных штаммов коринебактерии дифтерии, например штамма 4895. Т.е. ингибиторное действие нитротетразолиевого синего по отношению к токсигенному штамму неизбирательно. Задачей заявляемого изобретения является создание способа, позволяющего ингибировать протеолитическую активность внутриклеточных протеиназ избирательно токсигенного штамма. Поставленная задача достигается тем, что предложен способ ингибирования фибриногенолитической и казеинолитической активности внутриклеточных протеиназ в разрушенных путем замораживания-оттаивания или обработкой ультразвуком клетках токсигенного штамма-8, при этом к разрушенным клеткам добавляют гидрохинон в концентрации 10-3-10-2 М. Использование гидрохинона позволяет избирательно ингибировать активность внутриклеточных протеиназ только токсигенного штамма коринебактерии дифтерии. Изобретение иллюстрируется примерами. Пример 1. Используют 4 образца ( 1, 2, 3, 4) взвеси разрушенных (многократным замораживанием-оттаиванием либо ультразвуковой дезинтеграцией) клеток коринебактерии дифтерии 2 образца -1 и 2 токсигенного штамма -8 и 2 образца -3 и 4 нетоксигенного штамма 4895, выращенных на бульоне Лингуда без сыворотки крови, как подробно описано в 2. К образцам 1 и 3 добавляют раствор гидрохинона в конечной концентрации-2 10 М, а к образцам 2 и 4 - равный объем изотонического раствора хлорида натрия,образцы перемешивают. Аликвоты всех 4-х образцов наносят на фибриноген-агаровые пластины (концентрация фибриногена составляла 10 г/л, агар-агара - 10 г/л), приготовленные на 0,01 М фосфатном буфере 7,4, содержащем 0,15 М . Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой фибриноген-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывают по площади зон лизиса фибриногена 2. Площадь зон (в мм 2) расщепления фибриногена в образцах составила (3) в 1 - 0 в 2 - 16210 в 3 - 11714 в 4 - 15618. Следовательно, протеолитическая активность внутриклеточных протеиназ высокотоксигенного штамма подавлялась на 100 , тогда как нетоксигенного - лишь на 25 . 2 14796 1 2011.10.30 Пример 2. Используют 4 образца ( 1, 2, 3, 4) взвеси разрушенных (многократным замораживанием-оттаиванием либо ультразвуковой дезинтеграцией) клеток коринебактерии дифтерии 2 образца -1 и 2 токсигенного штамма -8 и 2 образца -3 и 4 нетоксигенного штамма 4895, выращенных на бульоне Лингуда без сыворотки крови, как подробно описано в 2. К образцам 1 и 3 добавляют раствор гидрохинона в конечной концентрации 10-3 М, а к образцам 2 и 4 - равный объем изотонического раствора хлорида натрия,образцы перемешивают. Аликвоты всех 4-х образцов наносят на казеин-агаровые пластины (концентрация казеина составляла 10 г/л, агар-агара - 10 г/л), приготовленные на 0,01 М фосфатном буфере 7,4, содержащем 0,15 М . Пластины с нанесенными пробами инкубируют при 37 С в течение 24 ч. Зоны лизиса визуализируют обработкой казеин-агаровых пластин 2 н. трихлоруксусной кислотой. Протеолитическую активность учитывали по площади зон лизиса казеина 2. Площадь зон (в мм 2) расщепления казеина в образцах составила (3) в 1 - 0 в 2 9012 в 3 - 908 в 4 - 10511. Следовательно, протеолитическая активность внутриклеточных перотеиназ высокотоксигенного штамма подавлялась на 100 , тогда как нетоксигенного - лишь на 14 . В неоптимальных для токсиногенеза условиях (добавление в бульон Лингуда сыворотки крови) ингибирования протеиназ токсигенного штамма гидрохиноном не проявляется. В концентрации 10-4 М гидрохинон не вызывает полного ингибирования протеиназ токсикогенного штамма. Таким образом, достигаемый технический результат заключается в том, что способ позволяет избирательно подавлять активность внутриклеточных протеиназ токсигенного штамма коринебактерий дифтерии, использовать доступный и более дешевый ингибитор. Данный способ может найти применение для направленной регуляции токсиногенеза в целях биотехнологии и перспективы разработки химиотерапевтических средств нового поколения при дифтерийной инфекции. Источники информации 1. Пыжова Н.С., Никандров В.Н. Особенности расщепления белков внутриклеточными протеиназамив оптимальных и неоптимальных для токсиногенеза условиях. Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки. Международная конференция. Тез. докл. - Минск, 2007. - С. 62-63. 2. Никандров В.Н., Пыжова Н.С., Шапчиц Н.С. Расщепление белков внутриклеточными протеиназамивлияние группоспецифических ингибиторов и перехватчиков активных форм кислорода // Доклады НАН Беларуси. - 2007. - Т. 51. -3. С. 92-97. Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20. 3

МПК / Метки

МПК: C12N 9/50

Метки: diphtheriae, активности, протеиназ, ингибирования, фибриногенолитической, казеинолитической, способ, corynebacterium, штамма, токсигенного, внутриклеточных

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/3-14796-sposob-ingibirovaniya-fibrinogenoliticheskojj-i-kazeinoliticheskojj-aktivnosti-vnutrikletochnyh-proteinaz-toksigennogo-shtamma-corynebacterium-diphtheriae-pw-8.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ ингибирования фибриногенолитической и казеинолитической активности внутриклеточных протеиназ токсигенного штамма Corynebacterium diphtheriae PW-8</a>

Похожие патенты