Способ создания калибратора ДНК Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis

Скачать PDF файл.

Текст

Смотреть все

НАЦИОНАЛЬНЫЙ ЦЕНТР ИНТЕЛЛЕКТУАЛЬНОИ СОБСТВЕННОСТИ(54) СПОСОБ СОЗДАНИЯ КАЛИБРАТОРА ДНК ПКЕАРЬАБМАПКЕАЬУТТСПМ ИЛИ МУСОРЬАЗМА НОМТЪПБ(71) Заявитель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последипломного образования (ВУ)(72) Авторы Хулуп Геннадий Яковлевич Бадыгина Наталья Александровна Костюк Светлана Андреевна Кустанович Анатолий Михайлович(73) Патентообладатель Государственное учреждение образования Белорусская медицинская академия последиплом ного образования (ВУ)Способ создания калибратора ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уг 1 сиш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15,заключающийся в том, что выделяют ДНК человека и однокопийную ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйс 11 ш или Мусор 1 а 5 ша 11 ошш 15, разводят их деионизованной водой до концентраций,соответственно, 20 мкг/мл и 2107 копий/мл или 2 мкг/мл и 2106 копий/мл, или 0,2 мкг/мл и 2105 копий/мл, или 0,02 мкг/мл и 2104 копий/мл, или 0,002 мкг/мл и 2103 копий/мл и смешивают растворы ДНК человека и однокопийной ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 в объемном соотношении 11.Изобретение относится к области медицины, а именно к способам создания калибратора ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 для построения калибровочных кривых, относительно которых проводят определение концентрации ДНК искомого возбудителя в биологическом материале методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени.Разработанный способ создания калибратора ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 для проведения ПЦР в реальном времени позволяет получить калибратор с известной концентрацией ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уг 1 сиш или Мусор 1 а 5 ша Пошшйз,который по своим молекулярно-биологическим свойствам и составу максимально приближен К биологическому материалу, полученному от пациента.Задачей заявленного способа является получить калибратор ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 с известной концентрацией ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйспш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15, содержащий ДНК человека, для построения калибровочной кривой при определении относительной концентрации ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уг 1 сиш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 в биологическом материале методом ПЦР в реальном времени с показа телями корреляции (К 2) между СТ и 103 10 концентрации ДНК в мл 2 0,9, эффективностью реакции (Е) 2 0,89.Поставленная задача достигается следующим образом.Предложен способ создания калибратора ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15, заключающийся в том, что выделяют ДНК человека и однокопийную ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уг 1 сиш или Мусор 1 а 5 ша Ьошшйз, разводят их деионизованной водой до концентраций, соответственно, 20 мкг/мл и 2107 копий/мл или 2 мкг/мл и 2106 копий/мл,или 0,2 мкг/мл и 2105 копий/мл, или 0,02 мкг/мл и 2104 копий/мл, или 0,002 мкг/мл и 2103 копий/мл и смешивают растворы ДНК человека и однокопийной ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15 в объемном соотношении 11.Предложенный способ поясняется графическим материалом.На фигуре представлено СТ - значение цикла, при котором пороговая линия и кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта пересекаются, где 1 - пороговая линия, 2 - кривая данных флуоресценции каждого амплификационного продукта.Для приготовления калибратора ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уг 1 с 11 ш из жидкой культуральной среды (В 1 ОМЕК 1 ЕПХ, Франция) ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш выделялась с использованием сорбентного метода.Геномную ДНК человека выделяли с использованием набора 6 епЕ 11 ЦеТМ МашшаПап бепошйс ВЫА Мппргер КН (Зйша, США) в соответствии с инструкциями производителя. В частности, лизат клеток обрабатывали протеиназой и РНКазой, после чего вь 1 сокомолекулярную геномную ДНК очищали на колонке.Концентрация ДНК возбудителя (копий/мл) рассчитывали с учетом размера генома Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш по формуле 1Полученную ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш разводили в деионизированной воде до кон 8,010 Ю копий/мл.центрации 2107 копий/мл. Затем проводили 10-кратное титрование до концентрации ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш 2103 копий/мл.Концентрацию ДНК человека определяли с использованием спектрофотометра при длине волны 260 нм по формуле 2Полученный образец ДНК человека разводили в деионизированной воде до концентрации 20 мкг/мл с последующим 10-кратным титрованием до концентрации ДНК человека 0,002 мкг/мл.Конечным этапом при создании калибратора ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш было смешивание в соотношении 11 соответствующих 5-ти образцов ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уг 1 сиш с концентрацией 2107 - 2103 копий/мл и 5-ти образцов ДНК человека с концентрацией 20,0-0,002 мкг/мл. Таким образом, конечная концентрация ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 уйсиш вПример апробации калибратора ДНК Пгеар 1 а 5 ша игеа 1 у 11 сиш.Методом ПЦР в реальном времени проведена амплификация в дублях 5-ти полученнь 1 х калибраторов с концентрацией ДНК Птеар 1 а 5 ша итеа 1 уйсиш 1107, 1106, 1105, 1104 и 1103 копий/мл и концентрацией ДНК человека 10,0, 1,0, 0,1, 0,01 и 0,001 мкг/мл.Для амплификации ДНК Птеар 1 а 5 ша итеа 1 уг 1 сиш использовали тест-систему АмплиСенс-РКТ Птеар 1 а 5 ша итеа 1 уйсиш. В пробирки с ПЦР-смесью-1 на поверхность засть 1 вшего воска раскапывают по 7 мкл верхней ПЦР-смеси, которая не должна проваливаться под воск и смешиваться с ПЦР-смесью-1, затем вносили по 10 мкл полученного калибратора с концентрацией ДНК Птеар 1 а 5 ша итеа 1 уйсиш в Диапазоне 1107 - 1103 копий/мл в дублях и 2-ух контролей, не содержащих ДНК (ЫТС). ЫТС реактив состоит из амплификационной смеси, где мишень ДНК-стандарта заменена водой. Амплификацию проводили с использованием термоциклера Когот-Сепе-ЗООО по следующей программе 95 С 5 мин 95 С - 20 сек, 65 С - 20 сек 72 С - 20 сек, 10 циклов 95 С - 20 сек, 60 С - 30 сек,72 С - 15 сек, 35 циклов.Выявление ДНК гена человека ЫАСК, содержащегося в полученном калибраторе ДНК Птеар 1 а 5 ша Щеа 1 уйсип 1, идентифицировали на основании анализа последовательностей гена с использованием следующих праймеров и зондов 5 ТССССАСАСАСАТССТАССА-ЗВ каждую из пробирок типа Еррепботг объемом 0,2 мл добавляли 15 мкл амплификационной смеси, состоящей из 6,85 мкл деионизованной водь 1, 2,5 мкл реакционной смеси(100 мМ Тт 15-НС 1 (рН 8,4), 50 мМ в КС 1), 4 мкл 25 шМ М 3 С 12, 0,2 мкл 25 мМ 11 ТТР, и 1,25 смеси, содержащей 20-кратную концентрацию праймеров и ТаМап-проб (конечная концентрация - 300 нМ праймеров и 200 нМ зондь 1) и 0,2 мкл ТаЧ-полимеразы. Добавляли 25 мкл минерального масла. Под слой масла вносили по 10 мкл анализируемого образца, а в пробирку отрицательного контроля - 10 мкл деионизированной водь 1. Пробирки закрь 1 вали и центрифугировали в течение 3-5 сек при 15 ть 1 с. об./мин при комнатной температуре на микроцентрифуге-вортексе. Амплификацию проводили с использованием термоциклера Когот-Сепе-ЗООО по следующей программе 95 С - 5 мин, 95 С - 15 сек,60 С - 60 сек 50 циклов. Каждь 1 й образец ДНК-стандартов бь 1 л проамплифицирован в дублях вместе с двумя ЫТС (По Тешр 1 аге Сопгто 1). ЫТС реактив состоял из сложной ДНК амплификационной смеси, где мишень ДНК-стандарта заменена водой.После обоих циклов амплификации ДНК Птеар 1 а 5 ша итеа 1 уг 1 сиш и ДНК гена человека ЫАСК кинетика амплификации ЫТС-проб не детектировалась.Средний уровень корреляции (112) между СТ и 10 10 концентрации ДНК Птеар 1 а 5 ша итеа 1 уйсиш (копий/мл) и между СТ и 103 10 концентрации ДНК гена человека ЫАСК(мкг/мл), содержащихся в созданном калибраторе ДНК Птеар 1 а 5 ша итеа 1 уйсиш, составила 0,99 и 0,98 соответственно. Средняя эффективность реакции составила 0,91 для ДНК Птеар 1 а 5 ша итеа 1 уг 1 с 11 ш и 0,89 для ДНК гена человека ЫАСК.Таким образом, заявленнь 1 й способ позволяет получить следующие преимущества создать калибратор с известной концентрацией ДНК Птеар 1 а 5 ша итеа 1 уйсиш или Мусор 1 а 5 ша 11 ош 1 п 15, по своим молекулярно-биологическим свойствам и составу максимально приближенному к биологическому материалу, полученному от пациента, что позволит при использовании серии даннь 1 х калибраторов построить калибровочную кривую с показателями корреляции (112) между СТ и 103 10 концентрации ДНК в мл 2 0,9 и эффективностью реакции (Е) 2 0,89 и получить более достоверную информацию об относительной концентрации ДНК возбудителя в биологическом материале.Национальный центр интеллектуальной собственности. 220034, г. Минск, ул. Козлова, 20.

МПК / Метки

МПК: C12Q 1/68

Метки: urealyticum, днк, создания, калибратора, способ, ureaplasma, mycoplasma, hominis, или

Код ссылки

<a href="http://bypatents.com/3-11635-sposob-sozdaniya-kalibratora-dnk-ureaplasma-urealyticum-ili-mycoplasma-hominis.html" rel="bookmark" title="База патентов Беларуси">Способ создания калибратора ДНК Ureaplasma urealyticum или Mycoplasma hominis</a>

Похожие патенты